마우스 녹내장에 공 촛점 안저 이미징 및 세포 형태 계측 : 신경 퇴행 중 망막 미세 아교 활성화의 생체 역학

다음 실험의 전반적인 목표는 망막의 생체 내 컨포칼 이미징을 통해 만성 녹내장의 마우스 모델에서 미세아교세포의 역학을 특성화하는 것입니다. 이는 비침습적 월간 컨포칼 검안경 또는 CSLO를 통해 망막과 시신경두의 형광 미세아교세포를 관찰함으로써 달성됩니다. 임계값 기반 세포 SOMA 분할 및 morpho를 사용한 실시간 이미지 분석은 미세아교세포 수 및 활성화의 변화를 정량화합니다.

결과는 살아있는 쥐의 월간 CSLO 이미징을 사용하여 만성 신경퇴행의 조기 진행 동안 미세아교세포 밀도 분포 및 형태학적 활성화의 동역학을 모니터링할 수 있음을 보여줍니다. GFP 양성 미세아교세포 마우스 뇌의 두 광자 공초점 이미징과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 망막의 CSLO 이미징을 통해 온전한 유기체에서 노화의 신경퇴행성 질환 진행을 통해 미세아교세포를 직접 관찰하고 모니터링할 수 있다는 것입니다. 저는 이 방법에 대한 아이디어를 exvivo를 시연한 후 처음으로 미세아교세포가 감지 가능한 신경 퇴행보다 앞선 나이에 J 마우스를 통해 어린 DBA의 중앙 준비 상태에서 강렬한 활성화와 클러스터링을 보였다는 아이디어를 얻었습니다.

검출 가능한 녹내장이 발생하기 전의 이러한 초기 선천성 면역 변화가 그녀의 신경 퇴행을 일으켰는지 여부를 묻기 위해 우리는 미세아교세포 변화를 추적하기 위한 생체 내 접근 방식을 확립해야 했습니다. 라이브 이미지 획득 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 기술자인 Caesar Romero가 시연합니다.작업을 시작하려면 CSLO 시스템을 시작하고 세션 정보를 입력합니다. 다음으로, 안전하게 이미징을 준비합니다.

깨끗한 55도 광시야 대물렌즈를 부착합니다. 마취제를 투여한 후 2분 후에 이미징 플랫폼 위에 마우스를 올려놓고 테이틱 드롭스를 사용하여 양쪽 동공을 확장시킵니다. 5분 후 마우스가 마취되었는지 확인합니다.

다음으로, 최소한의 압력을 사용하여 콘택트렌즈로 각 눈을 가립니다. 오른쪽 눈이 대물 렌즈와 만나고 궤도가 렌즈와 평행이 되도록 마우스 방향을 지정합니다. 동물을 제지할 필요는 없지만 대물렌즈에서 일정한 거리를 유지해야 합니다.

다음 10분에서 15분 동안 눈을 정렬하면 CSLO 라이브 이미징 시스템에서 안구 움직임을 추적하는 동안 마우스가 움직이거나 깜박이지 않습니다. 내부 망막의 안저 보기를 수집하여 이미징 세션을 시작합니다. 이를 위해.

820나노미터의 여기 파장에 해당하는 적외선 모드를 선택합니다. 그런 다음 레이저 출력을 100%로 조정하고 감도를 40%에서 60% 사이로 조정합니다.그런 다음 고속으로 작업하고 조이스틱을 사용하여 안구의 방향을 잡고 시신경 디스크와 망막 혈관 구조의 안저 보기를 수집할 준비를 합니다. 각막과 수정체에 부상이나 불투명도가 있는지 검사합니다.

이미지 획득에 영향을 줄 수 있는 결함이나 부상이 있는 눈을 연구에서 제외합니다. 이제 대물렌즈를 눈에 더 가까이 가져옴으로써 시신경두 또는 ONH의 표면인 시신경 디스크 영역을 찾습니다. 그런 다음 ONH의 중앙에 이미지를 놓습니다.

ONH를 올바르게 배치하는 것은 이미지 전체에서 균일한 초점과 임무를 얻는 데 중요합니다. 다음 단계는 망막의 내부 평면과 ONH를 시각화하는 것입니다. 기준 초점면의 경우, 59 및 60 디옵터에 해당하는 망막의 유리체 표면에 위치한 주요 혈관을 사용하거나 굴착된 시신경 디스크 영역에서 55 디옵터로 더 깊은 혈관을 사용합니다.

그런 다음 흰색 후광이 광학 디스크 주변의 대부분의 안저에 걸쳐 나타날 때까지 터치 패널의 손잡이를 사용하여 이미지 채도를 조정합니다. 그런 다음 해당 눈에 대한 최적의 대비를 나타내는 균일한 후광을 렌더링하는 더 낮은 채도를 선택합니다. 어두운 영역이 지속되면 카메라를 다시 정렬해야 할 수 있습니다.

이제 실시간으로 촬영된 평균 30개의 프레임을 통해 중앙 망막의 고해상도 안저 이미지를 수집하여 신호 대 잡음 비율을 개선하십시오. 이는 초당 4.7 프레임에 해당하며, 즉시 정규화되고 동일한 위치에서 GFP 양성 세포의 형광 이미지를 수집하도록 준비되었습니다. 터치스크린 패널에서 형광 이미징 모드로 전환하면 488 나노미터 레이저 여기와 460 - 490 나노미터 배리어 필터 세트가 있는 청색 레이저를 선택하고 획득을 100% 레이저 출력과 100 - 125% 감도로 설정할

이제 평균 100 x 스캔에 이르는 ONH의 단일 XY 포인트 이중 차원 형광 이미지를 수집합니다. 다음으로, 제어판에서 ONH 선택 복합체 주변의 망막의 다점 이미지를 캡처한 다음 검안경으로 비강 측두축을 가로질러 이동합니다. 이 소프트웨어는 새로 스캔한 영역의 평균을 자동으로 계산하고 실시간으로 스티칭합니다.

망막 영역의 이미지 품질이 평균을 낼 수 없을 만큼 충분하지 않은 경우 스캔 영역을 식별하는 녹색 원이 빨간색으로 바뀝니다. 결과 합성 이미지는 최대 1.7 x 4mm의 영역을 포함합니다. 합성 이미지를 획득하는 동안 주의해야 합니다.

고해상도의 이미지는 스캔 평균화 및 이미지 스티칭이 완료되기 전에 대물렌즈를 너무 빨리 움직이면 손실될 수 있습니다. 마취가 사라지기 시작하면 마우스가 심하게 숨을 쉬기 시작하고 이미징이 불가능해지기 때문에 이미징 세션이 종료되어야 합니다. 혈관 구조와 시신경 디스크를 랜드마크로 사용하여 시계열에 대한 안저 이미지를 순차적으로 정렬하는 것으로 시작합니다.

기존 이미지 편집 소프트웨어를 사용하면 O hs가 겹칠 때까지 모든 이미지를 정렬합니다. 맨 위 이미지는 드래그하는 동안 반투명합니다. 그런 다음 주요 혈관이 이전 이미지의 혈관 구조와 겹칠 때까지 각 이미지를 순서대로 회전하고 나중에 참조할 수 있도록 배열을 저장합니다.

각 이미지에 대해 보정된 각도를 기록하고 해당 단일 XY 포인트 형광 이미지에 적용합니다. 이제 Fluor render에서 정렬된 TIFF 파일을 열어 중앙 망막에 국한된 개별 GFP 양성 미세아교세포를 식별할 수 있습니다. 모든 셀을 시각화하려면 화면을 이미지로 채우고 렌더 뷰 복합 직교 및 보간을 정의합니다.

그런 다음 1.00 음영에서 0.58 감마, 255 채도점, 255 휘도, 195 알파 속성을 정의합니다. 보이는 두 RG 채널을 모두 선택하여 선택을 마칩니다. B 채널을 작업 공간 프레임에서 두 번 클릭하여 개별 셀을 분할하여 숨깁니다.

대부분의 셀이 최소한의 오버랩으로 마스킹될 때까지 낮은 임계값을 증가시키고 높은 임계값을 일정하게 유지하면서 셀 프로세스를 제외하여 빨간색 채널을 선택하고 임계값을 임계값화합니다. 마지막으로 capture 명령을 사용하여 마스킹된 셀이 있는 파일을 저장합니다. 래스터 그래픽 편집기에서 마스킹된 셀이 있는 이미지를 엽니다.

직접 관찰을 위해 그레이 스케일을 반전하고 해상도를 300DPI 이상으로 조정합니다. RGB 이미지는 TIF 파일로 저장됩니다. 라이브 이미지 분석의 다음 단계는 미세아교세포(microglial)로, 면적 정량화를 위해 SATA를 식별하기 위한 세분화 및 형태

intensity 측정이 가능한 소프트웨어를 사용하고 임계값을 기반으로 object counting을 수행합니다. 세그먼트화된 셀이 있는 TIFF 파일을 열고 최대 해상도를 위해 스플라인 크기 조정을 선택하고 더 나은 시각화를 위해 빨간색 채널을 흑백으로 선택합니다. 다음으로, 개별 세포를 분할하기 위해 연령에 따라 수평 직경을 1.4-1.7mm로 정의하여 이미지를 보정합니다.

따라서 MA, 빨간색 채널에 강도 임계값을 적용합니다. object count and account update 명령에서 threshold intensity 함수를 엽니다. 이 함수를 사용하여 개인을 나타내는 관심 영역의 각 임계값에 대한 양방향 매개변수를 추적할 수 있습니다.

다음으로, intensity histogram에서 intensity threshold를 정의합니다. 255개 수준 중 가장 낮은 50-60%를 선택하고 개별 셀의 최종 임계값을 구체화합니다. 파란색의 임계값 색상 마스크와 회색의 셀 소마 둘레 사이의 겹침을 이진 도구 모음 컨트롤 또는 개체 카탈로그를 사용하여 시각적으로 평가합니다.

여러 세포가 있는 관심 있는 솜털 영역을 수동으로 식별합니다. 관심 영역을 분리하여 이러한 요소를 분리합니다. 이 작업을 수행하는 동안 토글을 사용하여 영역 제한을 사용하여 셀을 직접 시각화합니다.

미세아교세포를 활성화된 것으로 분류합니다. 그들의 소마타 영역이 50-60 평방 미크론보다 큰 경우. 미세아교세포(microglia)가 더 작은 소마타(somata)가 있는 경우 비활성화된 것으로 분류합니다.

마지막으로, 솜털 마스크와 단일 XY 포인트 이미지를 대비가 50% 증가된 상태로 오버레이하여 프로세스를 확인하고 각 활성화된 미세아교세포의 분지 복잡성을 확인합니다.설명된 프로토콜을 사용하여 중앙 망막의 넓은 영역에 걸쳐 미세아교세포를 시각화했습니다. CX 3 C one GFP를 발현하는 젊은 DBA 2 J 마우스 이형접합체에서 라이브 이미지, 임계값 설정 및 형태 분석 분석과 결합된 높은 세포 해상도는 개별 GFP 양성 세포의 자동 분할을 가능하게 했으며, 따라서 세포는 지역 DBA 2 J 마우스 모델 만성 녹내장에 따라 구별되고 변수와 일치하는 검출 가능한 신경 퇴행을 진행하는 연령에서 국소 마이크로 신경교세포 및 미세아교세포 활성화의 발달을 모니터링하기 위해 매월 이미지화되었습니다 개별 눈의 신경 퇴행의 진행. 이 분석은 시간이 지남에 따라 망막 미세아교세포 활성화와 미세 신경교세포의 변화를 밝혔습니다.

이 분석은 또한 개별 망막 내에서 전체 및 활성화된 미세아교세포의 밀도에서 동적 변화를 감지했습니다. 미세아교세포 집단 밀도는 다른 발견과 일치하는 세포 밀도를 발현하는 GFP의 변화와 연결되지 않았습니다. 따라서 CSLO 분석은 조기 질병 진행의 지표로 사용될 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안, GFP와 미세아교세포의 형광 이미지의 채도 수준, 내부 망막의 국소화, 중앙 망막의 CSLO 이미지의 재현성, 중앙 망막에서 감지되는 일관된 세포 세부 사항은 개발 후 이 단계에 결정적으로 의존한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 라이브 이미징 프로토콜은 우리 실험실에 적용되고 있으며, 망막 및 시신경 두부 미세아교세포의 초기 변화와 DBA에서 JM으로의 녹내장의 후기 진행 및 다른 만성 망막 변성 모델 사이의 잠재적인 연관성을 진정으로 진정시키고 있습니다. 이 실시간 이미징 전략은 또한 다발성 경화증, 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 퇴행을 위해 망막과 시신경을 표적으로 하는 다른 만성 병리학을 조기에 감지할 수 있습니다.