ELISA 기반 바인딩과 경쟁 방법은 신속 리간드 - 수용체 상호 작용을 확인하는 방법

이 ELISA 기반 방법의 목표는 첫째, 사이토카인과 수용체 간의 결합 친화도를 결정하고 둘째, 리간드-수용체 상호작용의 억제 펩타이드의 차단 효과를 측정하는 것입니다. 이 방법은 단백질-단백질 상호작용 분야, 예를 들어 사이토카인-수용체 결합과 같은 주요 질문에 대한 답을 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 결합 친화도와 이러한 차단은 상호작용 역학에 대한 일반적인 이해를 높일 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 실행이 용이하고, 레이블 수용체를 생성하며, ELISA 리더와 같이 쉽게 접근할 수 있기 때문에 상대적으로 저렴하다는 것입니다. 이 방법은 사이토카인 수용체 상호작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 일반적인 단백질-단백질 상호작용 및 특정 상호작용을 억제하는 차단 화합물 설계와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 용액을 준비하십시오.

카보네이트 코팅 버퍼를 0.22 마이크론 PES 멤브레인으로 필터링하십시오. 진공을 사용하십시오. 또한 각 리간드 또는 펩타이드의 10가지 농도를 만드십시오.

이 비디오에는 두 가지 분석법이 설명되어 있습니다. 첫 번째는 직접 리간드 수용체 상호작용, ELISA입니다. 이는 수용체-리간드 해리 상수, 즉 수용체-리간드 결합 친화도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 두 번째 분석법은 최근 최적화된 경쟁 리간드-수용체 상호작용 ELISA입니다.

이를 통해 수용체-리간드 상호작용을 방해하는 펩타이드 및 기타 차단 화합물을 선별할 수 있습니다. 효율성을 위해 96정 플레이트용 다채널 피펫을 사용하도록 준비하고 배출할 때는 내용물을 버리십시오. 이 절차를 시작하려면 재조합 수용체로 플레이트를 코팅합니다.

먼저 카보네이트 버퍼에 수용체를 100 나노그램/마이크로리터로 희석합니다. 그런 다음 100 마이크로리터의 수용체 용액을 플레이트 웰에 로드합니다. 플레이트 가장자리 인공물을 처리하지 않도록 외부 벽을 제외합니다.

플레이트를 덮고 4도 섭씨에서 하룻밤 동안 배양합니다. 모든 플레이트 배양은 부드럽게 회전하면서 수행합니다. 다음 날, 코팅 용액을 제거하고 PBS에 약간의 Tween 20이 포함된 세척 용액으로 플레이트를 세 번 세척합니다.

그런 다음 200 마이크로리터의 5%PSA를 추가하여 자유 수용체 결합 부위를 차단합니다. 차단을 완료하기 위해 실온에서 2시간 동안 플레이트를 배양합니다. 나중에 웰을 비우고 이전과 같이 플레이트를 세척합니다.

이제 재조합 his-tag 리간드의 다양한 희석액 100 마이크로리터로 웰을 로드합니다. 각 농도를 중복하여 로드합니다. 블랭크 웰에는 PBS만 로드합니다.

그런 다음 실온에서 2시간 동안 플레이트를 배양합니다. 리간드로의 배양 후 세척 용액으로 플레이트를 세 번 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 100 마이크로리터의 일차 항-his 마우스 단일클론 항체를 피펫팅하고 실온에서 2시간 동안 플레이트를 배양합니다.

항체를 세척한 후 각 웰에 100 마이크로리터의 HRP 결합 염소 항-마우스 IGG 2차 항체 용액을 추가합니다. 빛을 피하기 위해 플레이트를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 그런 다음 실온에서 45분 동안 플레이트를 배양합니다.

표준 세척 기술을 사용하여 2차 항체를 제거합니다. 이제 각 웰에 100 마이크로리터의 신선한 TMB를 추가합니다. 이는 동등한 양의 스톡 기질 용액 A와 B로 만들어집니다. 그런 다음 플레이트를 실온에서 15분에서 30분 동안 유지합니다. 그런 다음 충분한 색 개발 후 각 웰에 50 마이크로리터의 스톡 용액을 추가합니다.