탈 신경 외과 피부 : 피부 질환의 마우스 모델에서 신경에 대한 요구를 테스트하기위한 방법

이 절차의 전반적인 목표는 정상 및 병적 피부에 미치는 신경의 영향을 조사하는 것입니다. 이 방법은 피부 신경이 항상성과 질병에 영향을 미치는지와 같은 정상 피부 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동일한 동물에서 온 온전한 피부 샘플과 신경이 제거된 피부 샘플을 비교할 수 있다는 점입니다.

신경은 주변 조직에 가해지는 손상을 최소화하면서 인식하고 제거하기가 어려울 수 있으므로, 이 기술에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 먼저, 마우스를 마취하고 발가락 꼬집기(toe pinch)를 통해 적절한 진정 단계에 도달했는지 확인하십시오. 또한, 마우스의 호흡과 심박수가 정상인지 확인하십시오.

이제 동물을 무균 수술 구역 내의 가온 패드 위에 올립니다. 전기 이발기를 사용하여 생검을 실시할 등 쪽의 털을 조심스럽게 제거합니다. 그다음 Betadyne과 알코올 솜을 사용하여 제모한 부위를 닦아냅니다.

해당 부위에서 모든 깎인 털이 제거되었는지 확인하십시오. 이제 검은색 마커를 사용하여 생검 부위의 외곽선을 그립니다. 모낭의 종단면을 얻으려면, 생검 부위의 긴 가장자리가 등쪽 정중선과 평행하게 전후 방향으로 위치해야 합니다.

메스를 사용하여 하부의 근막을 손상시키지 않도록 전층 절제를 수행합니다. 일반적으로 출혈은 최소 수준입니다. 생검 시료에는 표피, 진피, 피하 지방 및 판니쿨루스 카르노수스(panniculus carnosus)가 포함되어야 합니다.

절제한 피부 샘플을 마른 종이 타월 위에 진피 쪽이 아래로 향하도록 하여 펴줍니다. 불필요한 종이 타월 부분을 잘라내고, 다른 샘플을 추가로 수집해야 하는 경우 샘플을 차가운 TBS에 담가 최대 1시간까지 보관합니다. 다시 생쥐로 돌아가, 생검 부위를 60 nylon 봉합사로 약 3 mm 간격으로 봉합합니다.

그 후 마우스가 의식을 회복할 때까지 회복 케이지에서 관찰합니다. 지정된 기관 동물 관리 규정에 따라 진통제를 사용하고, 마우스가 고통스러워 보일 경우 해당 가이드라인을 따릅니다. 수술 후 7~10일 이내에 봉합사를 제거합니다.

조직학적 분석 또는 전체 마운트 염색을 위해 생검 조직의 처리 과정을 진행합니다. 동물을 마취시키고, 등 전체의 털을 제모한 뒤 생검 절차와 유사하게 해당 부위를 세척합니다. 이제 멸균 메스를 사용하여 목 기저부부터 꼬리 위쪽으로 약 0.5 cm 지점까지 등 중앙선을 따라 절개합니다.

멸균된 둔단 포셉을 사용하여 왼쪽 피부를 측면에서 부드럽게 젖혀, 목 근처의 견갑골 지방패드부터 뒷다리 바로 윗부분까지의 하부 조직을 시각화합니다. 이제 해부 현미경 하에서 등쪽 피부 신경을 식별합니다. 이 신경들은 흰색 가닥 형태로 나타나며, 몸통 벽의 반투명한 근막을 통해 꼬리 쪽으로 주행하다가 급격히 꺾여 피부 아래의 느슨한 결합 조직으로 들어갑니다.

다음으로, 초미세 핀셋을 사용하여 해부학적 위치 T3에서 T12에 해당하는 동물의 왼쪽 신경만을 제거합니다. 신경 세그먼트가 몸통 벽에서 꺾이는 지점부터 피부로 들어가는 진입 지점까지 잡아당겨 제거합니다. 핀셋을 수직으로 세워 꺾이는 지점에서 약 0.5 cm 아래의 신경을 잡습니다. 잡은 후 위쪽으로 당겨 신경을 늘려 주변 조직과 분리하여 제거합니다.

인접한 혈관이 손상되지 않도록 주의하십시오. 0.9% 생리식염수를 주기적으로 떨어뜨려 시술 과정 내내 조직이 촉촉하게 유지되도록 하십시오. 몸통 벽에서 피부로 뻗어 있는 모든 신경을 계속 제거하되, 몸통 벽의 조밀한 근막 내에 있는 신경은 손상시키지 마십시오.

다음으로, 노출된 피부 플랩에서 신경을 제거합니다. 이 섬유들은 등쪽 피부 신경의 원위 분지들로, 피부 플랩의 진피 측 결합 조직 내에 산재한 흰색의 분지 형태로 나타납니다. 이러한 미세 분지들을 제거하려면 핀셋을 진피 표면과 거의 평행하게 배치하고, 신경을 잡아 위로 뽑아냅니다.

이러한 방식으로 모든 가시적인 신경을 제거하십시오. 혈관과 피부를 천자하지 마십시오. 이 단계에서는 인접한 혈관이 파열되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.

인접한 혈관이 있는 신경을 발견한 경우, 혈관이 없는 부위까지 계속 따라간 뒤 뽑아내어 제거하십시오. 이제 등쪽 중앙 절개선의 우측 피부를 느슨하게 하되, 신경은 제거하지 마십시오. 이 부위는 반대측 가짜 수술 대조군으로 사용됩니다.

마지막으로 동물을 봉합하고 이전과 같이 수술 후 상태를 모니터링합니다. 이후 신경 손실이 안정적으로 유지되었는지 확인하기 위해, 수술 수주 후에 멸균 하이포더믹 바늘을 사용하여 신경이 제거된 부위를 가볍게 찌릅니다. 동물이 보통 몸을 떨거나 머리를 돌리는 방식으로 반응하는지 확인하십시오.

피부 부위가 안정적으로 탈신경화되었다면, 동물은 반응이 거의 없거나 전혀 나타내지 않을 것입니다. 반응이 없는 부위와 반대편의 가짜 수술(sham) 부위에서 피부 생검 조직을 채취하여 각각 실험군 및 대조군 샘플로 매칭합니다. 생검 조직에서 여러 개의 조직 절편을 샘플링하여 가짜 수술 표본과 탈신경화 표본 간의 촉각 돔(touch dome) 풍부도 또는 형태의 잠재적 차이를 식별하는 것이 중요합니다.

glebe one cree ERT2 마우스 계통을 이용하면 촉각돔 상피와 같이 hedgehog 경로 활성이 높은 피부 영역에 타목시펜 유도 유전자 재조합을 표적화할 수 있습니다. 이 마우스들을 induce abolaxi 리포터 마우스와 교배하여 촉각돔 상피를 시각화하였습니다. Node는 정상적인 촉각돔과 그와 연관된 메르켈 세포(Merkel cells) 모두를 유지하는 데 매우 중요합니다.

이는 신경 절단 후 정상적인 촉각 돔(touch dome) 형태의 점진적인 소실뿐만 아니라 keratin 8이 침착된 세포의 소실을 통해 실험적으로 입증됩니다. 신경은 sham 및 신경 절단된 피부 모두에서 Glebe 1 cree ERE2 발현과 home-mount beta collective sided 염색으로 모니터링한 바와 같이, 촉각 돔 내 hedgehog 신호 전달을 촉진하는 데에도 필수적입니다. 이 영상을 시청하고 나면, 이러한 신경이 정상적인 피부 기능에 관여하는지 또는 질환을 조절하는지 테스트하기 위해 배측 피부 신경을 외과적으로 절제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 기술을 숙달하면 동물에게 가해지는 스트레스를 최소화하면서 일상적이고 안정적으로 수행할 수 있습니다. 이 절차 이후에는 아미노 형광 염색과 같은 방법을 사용하여 신경이 피부에서 완전히 제거되었는지, 그리고 유전자 발현에 영향을 미치는지 확인할 수 있습니다.