차별화 운명의 공간 조직을 프로빙에 대한 인간 다 능성 줄기 세포의 스텐실 미세화

인간 다능성 줄기세포를 위한 이 스텐실 기반 마이크로패터닝 방법의 전반적인 목표는 줄기세포 분화 패턴을 조절하는 공간적 환경 구배를 생성하는 단순하고 견고한 수단을 제공하는 것입니다. 이 방법은 세포-세포 및 세포-기질 접착력의 공간적 구배가 줄기세포 분화 운명의 조직화에 어떻게 기여하는지와 같이, 인간 줄기세포 모델을 이용한 조직 패터닝의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 방법의 장점은 세포가 부착될 수 있는 세포 접착성 ECM 패턴을 생성하기 위해 추가적인 표면 개질이 필요하지 않다는 점입니다.

이는 해당 방법이 각 세포주에 특화된 다양한 ECM 및 기질 구성과 호환됨을 의미합니다. 마이크로패턴 형성 단계는 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이는 스텐실과 세포를 정밀하고 세심하게 다루어야 하기 때문입니다.

본 절차를 위해 PTMS 스텐실이 이미 설계 및 제작되어 있어야 합니다. 마찬가지로, 절차 후반부에 세포 파종이 가능하도록 기저막 매트릭스(basement membrane matrix)에서 인간 EFC 세포를 배양하십시오. 우선, 디쉬에 초순수로 희석한 70% 분석 등급 에탄올 700 microliters를 채웁니다.

그 다음, PDMS 스텐실을 용액 위에 놓고 디쉬를 생물안전작업대(bio-safety cabinet)에 넣어 하룻밤 동안 건조시킵니다. 다음 날, 스텐실 아래에 기포가 형성되지 않았는지 확인하십시오. 그런 다음, 세포를 스텐실 위에 파종할 수 있을 때까지 디쉬를 보관하십시오.

DMF12 16.7 milliliters를 첨가하여 1.5x 농도의 인간 ESC-품질 기저막 매트릭스 분주액을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 기판을 100 watts의 산소 플라스마로 90초 동안 처리하십시오. 디쉬는 플라스마 챔버 내부에 있을 때까지 열지 말고, 처리 후에는 빠르게 덮으십시오.

이 처리는 기질을 용액에 담글 때 기포가 형성되는 것을 방지합니다. 이제 준비된 1.5x basement membrane matrix 용액 450 µL를 스텐실 위에 덮습니다. 그런 다음, 파라필름으로 디쉬를 밀봉하고 5시간 동안 배양합니다.

진행하기 전에, 준비된 HESC 콜로니가 담긴 6-웰 플레이트를 확인하십시오. 전형적인 HESC 형태를 잃고 분화된 세포 콜로니를 식별하여 흡입 제거하십시오. 모든 콜로니는 둥근 모양이어야 하며, 조밀하게 밀집된 상피 형태와 뚜렷한 인을 가진 높은 핵-세포질 비율을 보여야 합니다.

그런 다음, 플레이트에 도말된 세포의 각 웰을 2 mL의 DMF12로 2회 세척합니다. 두 번째 세척 후, accutase와 같은 소화 효소 1 mL를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37 °C에서 8분 동안 배양합니다. 배양 후, 플레이트를 가볍게 두드려 기질에서 모든 콜로니를 분리합니다.

다음으로, 각 웰에 가해진 소화 효소 1 mL당 최소 4 mL의 배지를 사용하여 각 웰을 헹구고, 세포 현탁액을 하나의 15 mL 원추형 튜브에 수집합니다. 실온에서 200 g로 3분간 원심분리하여 세포 펠렛을 형성합니다. 그런 다음 상층액을 흡입하여 제거하고, 10 µM의 ROCK 억제제가 첨가된 400 µL의 HESC 유지 배지에 세포를 재현탁합니다.

세포 덩어리를 분산시키기 위해 세포를 부드럽게 3회 트리튜레이션합니다. 그다음, 현탁액의 밀도를 조정합니다. 잘 혼합한 후, 배지에서 200 microliter의 1:20 희석액을 만듭니다.

헤모사이토미터를 사용하여 희석액의 세포 수를 측정하십시오. 그 다음, rock 억제제가 포함된 배지를 사용하여 주 현탁액을 필요에 따라 희석하십시오. 계속 진행하려면, 준비된 각 스텐실에 필요한 수의 세포를 분주하십시오.

세포가 단층으로만 증착되어야 하므로, 세포를 고르게 펼쳐줍니다. 세포가 가라앉을 수 있도록 스텐실을 5분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음, 이동하는 동안 디쉬의 수평을 유지하며 적재된 스텐실을 인큐베이터로 조심스럽게 옮깁니다.

1시간 동안 배양하여 세포가 스텐실에 부착되도록 합니다. 세포 부착이 완료되면, 현미경으로 관찰하여 세포가 적절하게 부착되었는지 확인합니다. 스텐실을 다시 후드로 옮기고, 부착되지 않은 세포를 스텐실에서 흡입하여 제거합니다.

다음으로, 스텐실 주변 영역에 DMF12에 희석된 0.5% 호환성 비이온성 계면활성제 2 mL를 첨가합니다. 용액을 흔들어 스텐실 전체를 덮습니다. 그런 다음, 멸균된 핀셋을 사용하여 접시에서 스텐실을 조심스럽게 떼어냅니다.

스텐실을 제거한 후, 현미경으로 마이크로패턴화된 세포를 관찰하십시오. 비이온성 계면활성제는 이러한 세포들이 건조되는 것을 방지합니다. 계면활성제가 첨가된 배지 용액에서 마이크로패턴화된 세포를 37 °C에서 10분 동안 배양하십시오.

10분 후, 용액을 흡입하여 제거하고, 2 mL의 일반 DMF12 배지로 플레이트를 3회 세척합니다. 세척 후, 록 억제제(rock inhibitor)가 포함된 HESC 유지 배지 2 mL를 첨가합니다. 다시 한번 세포를 관찰하여 마이크로패턴이 적절하게 형성되었는지 확인합니다.

그 다음, 세포를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 배지를 흡입하여 제거하고 DMF12로 세포를 한 번 세척한 후, 세포의 중내배엽 분화를 유도하기 위해 보충제가 첨가된 분화 배지 2 mL를 첨가합니다. 이후 결과를 분석합니다.

레이저 커터를 이용한 세포 스텐실 제작을 통해 1000 µm 크기의 특징물을 구현하였습니다. 해당 스텐실은 미세 패턴의 관통 구멍이 있는 얇은 스텐실 시트와 세포를 가두기 위해 사용되는 PDMS 가스켓으로 구성되었습니다. 이 도구를 사용하여 중배엽-내배엽 분화 과정 중의 미세 패턴화된 HESCs를 연구하였습니다.

H9-HESC 콜로니 주변부는 콜로니 내부의 세포보다 인테그린 접착이 더 높게 나타납니다. 따라서 이 세포들에 activin, BMP4 및 FGF2를 처리하여 유도하면 brachiary T-양성 중내배엽 세포로 분화합니다. 이러한 세포들을 서로 다른 기하학적 구조의 단층으로 패턴화했을 때, 기하학적 및 등방성 직각과 볼록한 곡률 부위에서 인테그린 매개 견인력의 국소적 집중이 일어났으며, 이는 중내배엽 분화의 증가로 이어졌습니다.

단일 콜로니 내의 서로 다른 위치에서 T 발현 강도를 확인한 결과, meso endoderm 유도의 정도가 정사각형 및 직사각형 콜로니의 날카로운 모서리와 반원형 호의 볼록한 곡률 부위에서 실제로 더 높게 나타났습니다. 이는 세포 접착으로 매개되는 기계적 힘이 설명된 방법을 통해 조절될 수 있음을 보여줍니다. 본 절차를 수행하기 전에, 사용하는 특정 인간 만능 줄기 세포주에 맞게 매트릭스 코팅 시간, 세포 소화 및 부착 시간을 최적화하는 것이 중요합니다.