쥐 C1498 세포주와 관련 백혈병 마우스 모델을 특성화에 대한 자세한 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 Murine C1498 세포의 특성을 분석하고, 이를 마우스에 정맥 주사하여 유도되는 급성 백혈병을 규명하는 것입니다. 이 절차의 주요 장점은 C1498 세포 주입 후 유도된 마우스 골수성 단구성 백혈병이 인간 질환의 많은 특징을 나타낸다는 점입니다. 이러한 동물 모델은 백혈병 발생 및 면역 결핍을 유도하는 메커니즘이 무엇인지와 같은 혈액학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

이 동물 모델은 새로운 화학 요법 및 면역 치료제의 테스트를 용이하게 하여 백혈병 치료에 기여할 수 있습니다. 먼저 5~6주 된 암컷 동종 C57 black 6 마우스를 멸균 라미나 플로우 후드로 옮깁니다. 그런 다음, 동물을 보정기에 넣습니다.

다음으로, 29 gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기에 100 µL의 세포를 채웁니다. 꼬리의 원위부를 잡고 70% ethanol을 적신 거즈로 꼬리 피부를 소독합니다. 1 × 10⁶ 개의 세포를 측면 꼬리 정맥에 천천히 주입하십시오.

모든 세포가 주입되면 바늘을 제거하고 멸균 거즈로 주입 부위를 가볍게 압박합니다. 그 후 동물을 케이지로 옮기고 향후 몇 주 동안 주의 깊게 관찰합니다. 17~19일 후, 마취된 백혈병 모델 동물의 안구 내측 안각에 모세관을 삽입합니다.

안와 정맥동에서 100 내지 200 µL의 혈액을 모세관 튜브로 채취합니다. 튜브를 제거하고 멸균 거즈 스펀지를 눈 위에 부드럽게 눌러 지혈합니다. 그런 다음, 혈액을 EDTA 튜브로 옮기고 단핵구 분리 시까지 튜브를 얼음 위에 보관합니다.

혈액 단핵구를 분리하려면 먼저 1 mM EDTA가 포함된 PBS를 최종 부피 500 µL가 되도록 추가합니다. 그다음, 샘플을 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이어서, 30 gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기를 사용하여 혈액 아래에 분리 용액 500 µL를 조심스럽게 층이 지도록 넣으며, 이때 층이 섞이지 않도록 주의합니다.

원심분리를 통해 세포를 분리하고, 피펫을 사용하여 불투명한 흰색의 단핵구 층을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그 다음, 1 mL의 PBS로 면역 세포를 세척합니다. 세포를 원심분리하고, 염색 및 유세포 분석을 위해 펠렛을 600 µL의 FACS 버퍼에 재부유시킵니다.

골수를 분리하기 위해 마우스를 플라스틱 보드 위에 등으로 눕히고 사지를 고정합니다. 70% ethanol로 동물을 소독합니다. 그 다음, 각 다리의 관절 윗부분 대퇴골 상단을 절개하고 경골을 부드럽게 당겨 대퇴골에서 분리합니다.

포셉과 가위를 사용하여 뼈에서 피부와 근육을 제거하고, 뼈를 얼음 위의 페트리 접시로 옮깁니다. 가위를 사용하여 말단 부위를 제거합니다. 그런 다음 5 mL의 차가운 PBS가 담긴 10 mL 주사기에 연결된 26 gauge 바늘을 한 번에 하나의 뼈 끝에 삽입하여 골수를 접시로 씻어냅니다.

골수 세포를 분산시키기 위해 세포 현탁액을 바늘 끝으로 여러 번 통과시킵니다. 그 다음, 새로운 70 micron 필터를 통해 세포를 50 milliliter 원심분리관에 여과하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 세포를 원심분리하고 펠렛을 2 milliliter의 용해 버퍼(lysis buffer)에 다시 현탁합니다.

즉시 튜브에 차가운 PBS를 최대 50 milliliters까지 채우고 세포를 원심분리합니다. 그런 다음, 골수 펠렛을 차가운 FACS buffer에 1 $\times$ 10⁶ cells/milliliter 농도로 재현탁합니다. 염색을 위해 골수 세포를 준비하려면, 먼저 필터 카드가 부착된 일회용 챔버에 슬라이드를 넣고 챔버를 세포 원심분리기에 넣습니다.

각 필터 카드 챔버에 100 µL의 FACS 버퍼를 넣고 슬라이드를 짧게 원심 분리합니다. 원심 분리가 끝나면 각 챔버에 100 µL의 세포를 넣고 세포를 원심 분리합니다. 그 다음, 공기 중에서 건조시키기 위해 챔버에서 슬라이드를 조심스럽게 꺼냅니다.

골수 세포를 염색하려면 슬라이드를 May-Grunwald 용액이 담긴 코플린 자(coplin jar)에 5분 동안 담급니다. 다음으로, 슬라이드를 pH 6.8의 완충 용액이 담긴 자로 옮겨 1분 동안 둡니다. 그 후, 슬라이드를 Giemsa R 용액으로 옮겨 10분 동안 염색합니다.

그 후 pH 중성수로 10초 동안 세척합니다. 세척 후 슬라이드를 공기 중에서 건조시키고, 각 시료에 봉입제를 한 방울씩 떨어뜨립니다. 그런 다음 커버글라스의 한쪽 가장자리를 슬라이드 위에 놓고, 커버글라스를 세포 위로 조심스럽게 내리며 가볍게 눌러 기포를 제거합니다.

대조군 동물과 비교하여 C1498 세포가 주입된 동물은 세포의 모세포(blast)와 같은 외형을 통해 관찰되는 바와 같이 골수 내에 C1498 세포가 대량으로 침윤되어 나타납니다. 골수에 침윤된 C1498 세포는 각각 단구모세포(monoblastic)와 골수모세포(myeloblastic)를 나타내는 단구성 및 과립구성 표현형을 보이며, 이는 급성 골수단구성 백혈병의 특징입니다. C1498이 주입된 마우스의 혈액 샘플에서 단핵구 세포 빈도를 유세포 분석법으로 분석한 결과, 전체 백혈구 집단의 약 4분의 1이 백혈병 세포로 구성되어 있음을 알 수 있습니다.

T 및 B 림프구 빈도는 대조군과 C1498 주입 동물 간에 비슷하게 나타납니다. 그러나 단핵구 빈도는 급성 골수단핵구성 백혈병의 특징적으로 C1498 주입 마우스에서 더 높은 수준으로 관찰됩니다. 세포화학 및 May-Grunwald Giemsa 과정을 수행할 때는 적절한 pH 값, 온도 및 배양 시간을 유지하는 것이 중요합니다.

이 영상을 시청한 후에는 급성 골수단구성 백혈병을 특성화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술의 개발 이후, 혈액학 분야의 연구자들은 다른 동물 모델에서 자발성 및 유도성 급성 백혈병의 특성을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.