2016년 12월 25일
이 프로토콜은 간극 결합 채널을 통해 세포 간 통신을 측정하는 메스 로딩 형광 염료 전송 기술에 대해 설명합니다. 갭 접합부 간 통신은 조직의 항상성을 유지하고이 세포 신호의 중단은 건강에 악영향을 갖고있는 중요한 세포 과정이다.
전반적인 목표는 광범위한 체외 약리학 및 독성학적 요구에 부응할 수 있는 포유류 세포 집단을 통해 간연접 세포 간 통신을 측정하는 간단한 분석을 제공하는 것입니다. 이 방법은 간극연접 세포간 통신을 조절하지 않음으로써 화합물이 조직의 발달 또는 유지에 영향을 미치는지 여부와 같은 독성학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 독성 물질과 독소에 반응하는 많은 세포 집단에서 간극 접합 기능을 간단하고 빠르게 평가할 수 있다는 것입니다.
절차를 시연하는 것은 제 연구실의 학부 연구 조교인 Ajna Uzuni가 맡을 것입니다. 실험을 시작하려면 Eagle's modified medium과 5% fetal-bovine serum을 포함하는 35mm 직경의 배양판에 다섯 번째 WB-F344 쥐 간 상피 세포를 10번 3번 파종합니다. 100% confluence에 도달할 때까지 인큐베이터에서 세포를 배양하고 세포의 실험적 처리를 계속합니다.
용량 반응 실험으로 계속하기 위하여는, 이전에 준비된, 100%acetonitrile에 있는 phenanthrene의 2 millimolar 재고 해결책의 10 microliters 및 20 microliters를 추가하고, 100%acetonitrile에 있는 phenanthrene의 20 millimolar 재고 해결책의 4 microliters, 6 microliters 및 8 microliters를 원액의 각 추가한 양을 위한 성장 매체의 2 milliliter를 포함하는 세포의 3개의 격판덮개에 추가하십시오. 다음으로, 4 마이크로 리터, 6 마이크로 리터, 8 마이크로 리터, 10 마이크로 리터 및 20 마이크로 리터의 100 % 아세토 니트릴 용액을 2 밀리리터의 성장 배지를 포함하는 3 개의 세포 플레이트에 추가하여 차량 제어 역할을합니다. 아세토니트릴을 첨가한 후 플레이트를 배양합니다.
시간 응답 실험을 수행하려면 100% 아세토니트릴에 함유된 페난트렌의 20밀리몰 스톡 용액 7마이크로리터를 각 시점에 2밀리리터의 성장 배지를 포함하는 3개의 세포 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 각 시점에 대해 2밀리리터의 성장 배지를 포함하는 3개의 세포 플레이트에 100% 아세토니트릴 7마이크로리터를 추가하여 차량 제어 역할을 합니다. 지정된 각 시점에 대해 플레이트를 배양합니다.
배지를 부드럽게 부어 배양 배지를 버리십시오. 3ml의 PBS로 세포를 헹구고 헹굼 사이에 디캔트 또는 흡인합니다. PBS에 용해된 1밀리리터 루시퍼 옐로우 염료를 1밀리리터씩 각 세포 플레이트에 피펫으로 넣었습니다.
검지와 엄지손가락 사이에 메스를 끼워 염료를 세포에 미리 로드합니다. 배양판 가장자리에서 5mm 떨어진 곳에 메스를 수직으로 놓고 중력을 사용하여 메스가 이 수직 각도에서 15도 각도로 부드럽게 굴러갈 수 있도록 합니다. 전체 플레이트의 세 가지 다른 영역에 있는 세포 집단을 통해 블레이드를 굴립니다.
다음으로, 실온에서 3분 동안 LY 용액으로 세포를 배양합니다. LY를 디캔트 또는 흡인하고 세포를 헹구어 모든 세포 외 염료를 제거하고 여분의 세포 배경 형광을 제거합니다. 그런 다음 0.5ml의 4% 인산염 완충 포르말린 용액을 첨가하여 세포를 고정합니다.
200x 배율에서 epifluorescence microscope를 사용하여 고정된 세포를 볼 수 있습니다. 들여쓰기 선이 수평 시야와 평행이 되도록 모든 플레이트를 정렬합니다. 일련의 SL-DT 이미지는 페난트렌의 증가 복용량으로 처리된 WB-F344 쥐 간 상피 세포의 생성되었습니다.
루시퍼 옐로우 형광 염료 이동의 감소는 페난트렌의 복용량 증가로 인해 발생하며, 이는 간극연접 세포간 통신(GJIC)의 독성 유발 억제가 증가하고 있음을 보여줍니다. SL-DT 이미지로부터 얻은 대조군 또는 FOC 값의 비율을 평균화하고 통계적으로 분석한 다음 그래프로 표시했습니다. 이 절차에 따라 추가 질문에 답하기 위해 단일 형질도입 단백질의 웨스턴 블롯과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.
예를 들어, 이러한 화합물이 세포 천공의 유사분열 사건을 활성화하고 있습니까?
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
본 프로토콜은 갭 결합(gap junction) 채널을 통한 세포 간 통신을 측정하는 스칼펠 로딩-형광 염료 전이 기술을 설명합니다. 이 방법은 조직 항상성 이해에 필수적인 포유류 세포의 갭 결합 세포 간 통신을 평가하는 간단한 분석법을 제공합니다.
간극연접 세포 간 통신(GJIC)은 독성 물질에 의한 조직 항상성 파괴를 평가하고 천연물의 보호 효과를 분석하기 위한 기능적 바이오마커로 활용됩니다. 메스 로딩-형광 염료 전이(SL-DT) 기술은 GJIC 억제 정도를 집단 수준에서 신속하게 평가할 수 있게 하여, 초기 발견 단계에서 기전적 위험 제거(de-risking)를 지원합니다. 이 분석법은 장기 기능에 중요한 세포 통신 경로에 미치는 영향을 바탕으로 화합물의 우선순위를 정하는 데 예측 신뢰도를 제공합니다.
SL-DT 분석은 메커니즘 분석을 위한 초기 발견 단계의 도구로 활용되며, 리드 최적화 이전에 조직 파괴 위험이 높은 화합물을 걸러내기 위해 배치됩니다.