Adenofection : 고갈-구조 실험에 의해 세포 Morphodynamics 분자 샤페론의 역할을 공부하는 방법

본 방법의 전반적인 목표는 단일 세포 수준에서 생물학적 과정의 기능 분석을 위해, 세포의 무결성과 단백질 항상성이 유지되는 조건 하에서 결핍 회복 실험(depletion rescue experiments)을 수행할 수 있도록 하는 것입니다.

이 방법은 유사분열 및 세포 분화와 같은 세포 역학에서 단백질 기능과 구조적 요구 사항에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 단백질을 고갈시키는 동시에, 대부분의 세포 집단에서 해당 단백질의 변이체를 생리적 수준에 가깝게 재도입할 수 있다는 점입니다.

먼저 유리 바닥 배양 접시를 fibronectin으로 코팅합니다. 이를 위해 1 mg/mL 농도의 fibronectin 스톡 용액을 멸균된 PBS로 1:100 비율로 희석합니다.

전체 표면을 덮을 수 있도록 각 35 mL 디쉬에 1 mL를 추가합니다. 37 °C, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양합니다. 배양하는 동안, 10% FBS가 첨가된 alpha MEM과 0.05% trypsin EDTA 분주액을 37 °C로 예열합니다.

45분 동안 배양한 후, 세포 용액 준비를 시작합니다. HeLa-RFP-H2B 세포가 담긴 10 centimeter 플레이트에서 배지를 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 0.05% trypsin EDTA 1.5 milliliters로 부드럽게 두 번 헹굽니다.

마지막 흡입 후 플레이트에 0.5 milliliters의 trypsin EDTA를 남겨두고, 37 °C 및 5% carbon dioxide 조건에서 세포를 2~3분 동안 배양합니다.

플레이트를 가볍게 두드리고 현미경으로 세포층을 관찰하여 모든 세포가 떨어져 나갔는지 확인하십시오. 그런 다음 배지 10 milliliters를 첨가하고 파이펫으로 여러 번 가볍게 섞어 세포를 분리한 후, 세포 현탁액을 15 milliliter 튜브로 옮기십시오.

헤모사이토미터를 사용하여 세포 현탁액 샘플 10 µL를 계수합니다. 다음으로, 유리 바닥 배양 접시에서 피브로넥틴 용액을 흡입하여 제거합니다. 세포를 도말하기 전에 피브로넥틴이 마르지 않도록 주의하십시오.

35 mm 디시당 2 mL의 배지에 1.5 × 10⁵ 개의 세포를 분주할 수 있도록 세포 현탁액을 준비합니다. 바이러스 형질전환 전의 세포 수를 측정하기 위해 실험 조건 수 외에 35 mm 플레이트 하나를 추가로 분주합니다. 30분에서 45분 동안 배양합니다. 배양 시간이 지난 후, 여기에서 보는 것과 같이 세포가 잘 분리되었는지 현미경으로 확인합니다. 플레이트를 배양기로 다시 옮겨 다음 날까지 세포를 배양합니다.

분주 다음 날, 세포 밀도가 최소 50%에 도달했는지 확인하십시오. 세포 밀도가 50%보다 낮으면 바이러스 형질도입 효율이 감소하고, 세포당 단백질 발현의 변동성이 증가하며, 세포 독성이 증가합니다. 그 다음, 이전과 동일하게 추가로 분주한 디쉬에서 세포를 수확하고 세포 수를 측정하십시오. 세포의 효율적인 형질도입에 필요한 바이러스 부피를 계산하십시오. 각 조건별로 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브에 라벨을 붙이고, 따뜻한 alpha MEM minus 400 microliters를 추가하십시오. 얼음 위에서 바이러스 분주액을 천천히 해동한 후, 필요한 부피의 각 바이러스를 튜브에 넣고 피펫팅으로 부드럽게 혼합하십시오. 이어서, 세포에서 배지를 흡입하여 제거한 후, 바이러스 혼합액을 방울방울 조심스럽게 추가하십시오. 세포를 37 degrees Celsius, 5%carbon dioxide 조건에서 배양하십시오. 한 시간 동안 15분마다 멸균 후드 내에서 플레이트를 조심스럽게 흔들어 바이러스가 세포 전체에 덮이도록 하십시오. 적은 양의 배지를 사용하면 바이러스와 세포의 접촉이 용이해집니다.

배양 후, 각 플레이트에 alpha MEM minus 1.6 milliliters를 조심스럽게 피펫팅하여 총 부피를 2 milliliters로 맞춥니다. 그런 다음, 2 millimolar thymidine을 첨가하여 세포 동기화를 시작하고 세포를 2시간 동안 추가로 배양합니다.

그동안 마이크로튜브에 멸균수 139 µL, 1 M 염화칼슘 50 µL, 20 µM siRNA 11 µL를 넣어 siRNA transfection 혼합물을 준비합니다. siRNA가 필요하지 않은 경우에는 siRNA 양만큼 멸균수로 대체하여 empty transfection을 수행합니다. HBSS-2X 용액을 염화칼슘 siRNA 혼합물에 천천히 한 방울씩 첨가합니다. 침전물의 크기가 작을수록 transfection 효율이 높아지므로, 200 µL 피펫을 사용하여 공기 주입 방식으로 두 번 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 상온에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 각 플레이트에 200 µL씩 천천히 한 방울씩 첨가하고 흔들어 섞어줍니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 16시간 동안 배양합니다.

다음 날, 배양 접시를 인큐베이터에서 꺼내 조직 배양 후드로 옮깁니다. 따뜻한 HEPES 2 mL로 세포를 두 번 헹군 후, alpha MEM minus 2 mL를 첨가하고 다시 인큐베이터로 넣습니다.

7시간 후, 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣기 전에 2 mM thymidine을 첨가합니다. 온도 변화가 세포 주기의 길이에 영향을 미치므로 한 번에 4개의 세포 플레이트 이하로 작업하십시오. 다음 날, siRNA transfection 및 바이러스 감염 48시간 후에, 따뜻한 PBS 2 mL로 세포를 두 번 헹군 다음, 살아있는 세포 이미징을 위해 phenol red가 없는 alpha MEM 2 mL를 첨가합니다. 7시간 동안 배양합니다.

가습 장치와 5% carbon dioxide 온도 조절 챔버가 장착된 도립 현미경을 사용하여 분열기 세포에 대한 단기 라이브 셀 이미징 실험을 수행합니다. 이미지 획득 전, 챔버가 37 degrees Celsius의 적절한 온도에 도달했는지 확인하십시오.

배지와 온도의 적절한 평형을 이루고 온도 변화로 인한 초점 밀림을 방지하기 위해, 이미지 획득 1시간 전에 배양 접시를 현미경 챔버에 넣습니다. 세포의 유사분열 상태를 확인합니다. 이 시점에서 세포의 10~15%가 유사분열 초기 단계에 있어야 합니다.

평형화 시간 동안 이전 실험에서 결정된 획득 파라미터를 설정하십시오. 광퇴색(photo-bleaching) 없이 적절한 해상도를 달성하는 것이 중요한데, 이는 광퇴색이 세포 손상을 일으키고 유사분열 진행을 방해하기 때문입니다. 획득 간격을 초과하지 않으면서 분석에 필요한 충분한 수의 세포를 확보하기 위해, 조건당 유사분열 진입 단계에 있는 세포들이 포함된 여러 시야(field)를 선택하십시오. 모든 시야 선택이 완료되면, 초점을 다시 맞추고 가능한 한 빠르게 획득을 시작하십시오.

스피닝 디스크 공초점 시스템을 사용하는 일반적인 설정은 4가지의 서로 다른 조건, 플레이트당 7개의 시야, 그리고 75분 동안 1.5분에서 2분 간격의 2가지 색상 채널을 포함합니다. 사용하는 형광 마커에 따라 세포의 유사분열 표현형을 분석하기 위한 명확한 기준을 결정하십시오.

왼쪽에 나타난 BAG3-GFP의 플라스미드 DNA transfection과 대조적으로, 오른쪽에 표시된 재조합 아데노바이러스를 이용한 adenofection은 낮은 감염 다중도(multiplicity of infection)에서도 대부분의 세포 집단에서 더욱 균질하고 효율적인 BAG3-GFP 발현을 가능하게 합니다. 이 대표적인 western blot은 BAG3 특이적 siRNA와 재조합 아데노바이러스 BAG3-GFP를 이용한 adenofection을 통해 내인성 BAG3를 효율적으로 제거하고, BAG3-GFP 단백질을 내인성 수준에 가깝게 재도입할 수 있음을 보여줍니다. 여기에서 보듯, proteotoxic stress 유도제인 MG132로 처리한 HeLa 세포와 달리, adenofection이 수행된 HeLa 세포에서는 스트레스 유도 열충격 단백질(heat shock proteins) 수준의 검출 가능한 증가가 없으므로 adenofection이 단백질 항상성을 유지할 수 있음을 알 수 있습니다. 대조군 siRNA와 BacMam-GFP alpha Tubulin, 그리고 BacMam-RFP Actin으로 adenofection된 HeLa 세포의 confocal time lapse 이미지에서 확인되듯이, 세포의 유사분열 진행은 adenofection에 의해 유의미하게 방해받지 않습니다.

그래프는 비정상적인 유사분열을 보이는 세포의 비율을 나타냅니다. BAG3 특이적 siRNA만을 형질전환한 세포는 빨간색 막대로 표시된 바와 같이 유사분열 결함 수준이 약 2배 증가했으며, 검은색 막대로 표시된 BAG3-GFP의 재도입을 통해 대조군 세포 수준에 가깝게 회복되었습니다.

이 영상을 시청하고 나면, adenofection을 이용한 결핍 구조 실험(depletion rescue experiments)을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 방법은 다양한 세포 배경에서 구조-기능 분석을 위한 하이포모픽 넉다운(hypomorphic knock-downs)을 생성할 수 있는 빠르고 간단한 시스템을 제공합니다. 이 방법을 통해 특정 기능에 필요한 표적 단백질의 핵심 구조적 요구 사항을 확인할 수 있습니다. 이후 게놈 편집의 다른 접근 방식들을 사용하여 관련된 메커니즘을 더욱 심층적으로 연구할 수 있습니다.