세포 분화 및 견인 힘의 상관 관계 분석을위한 높은 처리량 세포 마이크로 어레이 플랫폼

이 세포 마이크로어레이 플랫폼의 전반적인 목표는 세포 분화와 견인력 모두의 측정을 미세환경 컨텍스트의 함수로 상호 연관시키는 것입니다. 이 방법은 조직 공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 줄기 세포 생물학에 대한 근본적인 조사와 분화 프로토콜의 최적화를 모두 가능하게 합니다. 이 기술의 주요 장점으로는 처리량, 생화학 및 생물물리학적 단서를 다양화할 수 있는 능력, 면역형광과 견인력 현미경(TFM)에 의한 종말점 판독

이러한 방법을 사용했지만 간 전구 세포 분화를 이해하는 사람들은 다른 동맥 세포 유형 및 조직 맥락에 쉽게 적용 할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 실험의 성공이 배열 프로토콜과 고품질 하이드로겔 기질 및 견인력 현미경의 통합에 달려 있기 때문에 매우 중요합니다. TFM을 사용하여 세포 기질 상호 작용의 실시간 평가를 위해 실란화된 35mm 유리 바닥 페트리 접시에 폴리아크릴아미드 하이드로겔을 함유한 형광 비드를 제작하려면 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 용액에서 유리 기질을 준비합니다.

실란화된 35mm 유리 바닥 페트리 접시를 유리 건조 트레이에 놓고 20마이크로리터의 9:1 프리폴리머 비드-광 개시제 용액을 각 접시의 중앙에 피펫팅합니다. 거품이 생기지 않도록 12mm 원형 커버 슬립으로 각 접시를 부드럽게 덮습니다. 하이드로겔 표면에 형광 구슬을 분포시키려면 접시를 뒤집어 실온에 20분 동안 두십시오.

거꾸로 된 상태에서 접시를 365나노미터 UVA에 10분 동안 노출시킵니다. 필요에 따라 중합 시간을 최적화합니다. 다음으로, 하이드로겔을 1몰 HEPES 완충액에 담그고 실온에서 밤새 어두운 곳에 둡니다.

면도기로 커버 슬립을 조심스럽게 제거하고 중합된 하이드로겔이 손상되지 않도록 주의하십시오. 하이드로겔을 섭씨 50도의 핫 플레이트에서 건조될 때까지 탈수합니다. 하이드로겔은 실온에서 어두운 곳에서 3개월 동안 보관할 수 있습니다.

생체 분자를 인쇄하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 소스 플레이트를 위한 완충액을 준비합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 클린 핀을 로드한 후 마이크로어레이를 준비하고 제조업체 소프트웨어를 사용하여 프로그래밍합니다. 그런 다음 가습기를 켭니다.

설정값을 65% 상대 습도로 조정하고 레오미터가 설정값과 일치할 때까지 기다립니다. 소스 플레이트를 적절한 어댑터에 놓습니다. 그런 다음 탈수된 하이드로겔 기판을 적절한 어댑터에 넣습니다.

소스 플레이트의 레이아웃, 어레이 디자인 및 원하는 형식을 정확하게 반영하도록 프로그램의 매개 변수를 조정합니다. 어레이 제작을 시작합니다. 습도가 상대 습도 65% 이하로 떨어지지 않았는지, 핀이 막히지 않았는지 시간당 한 번 이상 확인하십시오.

습도가 예기치 않게 떨어지면 가습기를 채우고 관련 결로 튜브를 청소하기 위해 배열을 일시 중지하십시오. 핀이 막힌 경우 배열을 일시 중지하여 핀을 청소하거나 미리 청소된 핀으로 교체하십시오. 프로그램이 완료되면 제작된 어레이를 알루미늄 호일로 덮인 슬라이드 상자 또는 마이크로 플레이트에 넣습니다.

어레이를 65% 상대 습도의 실온에서 밤새 그대로 두십시오. 우리의 경험에 따르면 가장 일반적인 어려움은 어레이 제작과 관련이 있습니다. 형광 표지된 분자, 일반 단백질 염색 및 면역 불소화액을 사용하여 제작된 어레이의 기술적 품질과 견고성을 확인하는 것이 좋습니다.

제작 다음 날, PVS에서 페니실린-스트렙토마이신 부피당 1% 부피의 3mL에 어레이 35mm 페트리 접시를 담그십시오. 배열된 기판을 UVC에 30분 동안 노출시킵니다. 그런 다음 페니실린-스트렙토마이신 용액을 세포 배양 배지로 교환합니다.

세포를 수집하고 계수한 후 35mm 페트리 접시당 3mL로 어레이에 세포를 파종합니다. 섭씨 37도 및 5%CO2에서 2시간 동안 또는 잘 채워진 세포 섬이 형성될 때까지 어레이 배양물을 배양합니다. 파종 밀도와 시간은 세포 및 특정 응용 분야에 따라 조정할 수 있습니다.

세포섬 형성을 허용한 후 예열된 세포 배양 배지 3mL로 어레이 배양액을 두 번 세척합니다. 이 시점에서 관심 있는 적절한 제어 및 치료법을 생물학적 시스템에 추가할 수 있습니다. 모든 처리의 농도를 유지하기 위해 1-2일에 한 번씩 어레이의 매체를 교체하십시오.

어레이 배양을 시작한 후 1일에서 5일 이내에 TFM을 사용하여 세포 기질 상호 작용에 대한 실시간 평가를 수행합니다. 어레이 배양물이 들어있는 35mm 페트리 접시를 TFM 측정을 위한 로봇 스테이지가 있는 인큐베이션 도립 형광 현미경으로 이동합니다. 한 접시에서 위상차 현미경을 사용하여 개별 세포 섬의 위치와 초점 평면을 표시합니다.

원적외선 형광 현미경으로 전환하여 비드를 시각화합니다. 그런 다음 이전 단계에서 저장된 각 위치로 돌아가서 초점 평면의 z 좌표를 수정하여 세포 섬 아래에 있는 구슬의 첫 번째 층에만 초점이 맞춰지도록 합니다. 새 좌표를 저장하고 모든 세포섬에 대한 자동 이미징을 진행하여 해리 전 위상 대비와 근적외선 형광 이미지를 캡처합니다.

다음으로, 150마이크로리터의 BSA/SDS 용액을 접시에 조심스럽게 넣고 기질에서 세포가 완전히 분리될 때까지 5분 동안 기다립니다. 위상차 현미경을 사용하여 세포 해리를 모니터링합니다. 세포 섬이 기질에서 해리된 후 표시된 위치로 돌아가서 비드의 첫 번째 층이 여전히 초점이 맞춰져 있는지 확인합니다.

이러한 비드가 셀에서 생성된 견인에 의해 유도된 변형으로 인해 평면을 벗어난 경우 초점이 맞춰진 평면의 z 좌표를 수정하여 다시 초점이 맞춰지도록 합니다. 보정된 z 좌표를 저장하고 모든 고립영역에 대한 자동 이미징을 반복하여 해리 후 원적외 형광 이미지를 캡처합니다. 나머지 요리에 대해 이 단계를 반복합니다.

단백질 A/G는 노치 리간드가 들쭉날쭉하고 델타와 같은 리간드는 하이드로겔에서 향상된 보유력을 보여주었습니다. 노치 리간드 제시는 또한 녹색 담관 세포 마커의 존재에서 알 수 있듯이 담관 세포 운명을 향한 간 전구 세포의 분화를 유도했습니다. 노치 리간드에 대한 반응은 5개의 ECM(extra-cellular matrix) 단백질에 대해 정량화되었으며 리간드에 대한 간 전구 세포의 반응이 ECM 컨텍스트에 따라 달라진다는 것을 보여주었습니다.

작은 헤어핀 RNA 녹다운(knockdown)을 사용하여 리간드 델타(ligands delta)가 없는 전구세포(progenitor)를 생성했습니다. 그런 다음 세포에 노치 리간드가 들쭉날쭉한 1, 델타가 1과 같고 델타가 4와 같이 제시되었습니다. 배열된 노치 리간드에 대한 반응은 두 리간드의 세포 고유 발현에 따라 달랐습니다.

이러한 이미지는 간 전구 세포의 분화가 기질 강성과 ECM 구성에 따라 달라지는 것을 보여줍니다. 정량적 분석에 따르면 콜라겐 4는 부드러운 기질과 뻣뻣한 기질 모두에서 분화를 지원하는 반면, 피브로넥틴은 뻣뻣한 기질에서만 분화를 지원하는 것으로 나타났습니다. 대표적인 히트맵은 콜라겐 4의 낮은 기질 강성에서 지속적인 견인 응력이 담관 세포로의 분화를 촉진한다는 것을 시사합니다.

이 발견은 견인 응력의 평균 제곱근 값의 정량화에 의해 확인되었습니다. 이 비디오와 함께 제공되는 프로토콜은 하이드로겔 및 어레이 제작, 어레이된 기질에서 세포 배양을 수행하고, 견인력 현미경을 사용하여 세포 기질 상호 작용을 측정하기 위한 주요 단계를 제공했습니다. 기술에 익숙해진 후 적절하게 수행하면 각 실험을 1-2주 이내에 완료할 수 있습니다.

이 방법과 함께 세포 배양을 사용하여 정성적 PCR, 면역 블로팅, 표준 스케일 기계생물학 축 또는 기타 보완적인 분자 생물학 기술을 사용하여 고득점 어레이 조건을 검증해야 합니다. 이 다재다능한 플랫폼은 줄기세포 분화 및 암세포 생물학을 포함한 광범위한 세포 및 조직 맥락에서 세포 기능에 대한 고처리량 조사에 적용할 수 있습니다.