향상된 순도와 다양성에 차 미세 아교 세포의 신속하고 세련된 CD11b를 자기 절연

CD11b 자기 미세아교세포 분리의 전반적인 목표는 다양한 인 비트로(in vitro) 실험을 위해 비교적 짧은 시간 내에 높은 순도의 출생 후 미세아교세포 최종 수득량을 얻는 것입니다. 이 방법은 신경 염증과 관련된 신호 전달 메커니즘과 같이 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 현재 사용 가능한 다른 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 순도, 수득량 또는 생존율의 손실 없이 분리 과정이 약 30분 정도 소요된다는 점입니다.

먼저 1~2일 된 생후 마우스 새끼의 갓 절단된 머리를 층류 정화 작업대(laminar airflow hood)로 옮깁니다. 그 다음, 4.5인치 직선형 미세 해부 가위를 사용하여 절단 부위로 형성된 개구부에 가위 끝을 삽입하고 미측에서 두측 방향으로 절개하여 두개골과 뇌수막에 작은 절개창을 만듭니다. 절개를 마친 후, 한쪽 반구를 옆으로 젖혀 걷어냅니다.

그 다음, 곡선형 또는 훅 모양의 핀셋을 사용하여 뇌 전체를 제거합니다. 뇌를 0.25% trypsin EDTA 2 mL가 들어 있는 50 mL 튜브로 옮기고, 37 °C 항온수조에서 15분 동안 배양합니다. 신선한 성장 배지를 넣었다가 제거하는 방식으로 뇌를 세척합니다.

세척이 완료되면 뇌 하나당 2 mL의 성장 배지를 추가하고, 뇌를 분쇄하여 균질화합니다. 뇌 조직의 크기가 줄어들지 않으면 더 작은 구경의 피펫으로 교체합니다. 분쇄가 끝나고 덩어리가 보이지 않고 현탁액이 투명해지면, 70-micron 세포 체(cell strainer)에 현탁액을 통과시켜 단일 세포 배양액을 만듭니다.

그 다음, 뇌 하나당 두 개의 플라스크를 사용하여 T75 플라스크에 8~9 mL의 배지를 피펫으로 넣고, 각 플라스크에 1 mL의 뇌 균질액을 추가합니다. 16일째에 분리할 때까지 세포를 배양합니다. 16일 후에 플라스크의 배지를 새로운 50 mL 튜브로 옮깁니다.

각 T75 플라스크에 0.25% trypsin EDTA 3 mL를 첨가합니다. 그런 다음 오비탈 셰이커를 사용하여 실온에서 5분 동안 플라스크를 흔들어 줍니다. 배양액을 0.4 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.

5분 동안 흔들어 섞은 후, 원심분리한 배양액을 최소 4 mL 첨가하여 trypsin EDTA 반응을 중단시키고, 모든 세포가 완전히 떨어져 나왔는지 확인하기 위해 피펫팅(triturate)합니다. 그런 다음 70-µm 세포 스트레이너에 세포를 통과시켜 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 세포 수를 측정하고, 0.4 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.

다음으로, 5mL 폴리스티렌 튜브를 준비하여 권장 배지 1mL를 넣고 액면(meniscus)을 표시합니다. 권장 배지를 2.5mL까지 추가하고, 이 액면 또한 표시합니다. 그 후 배지를 제거하고, 펠릿을 권장 배지 500µL에 다시 현탁합니다.

이 혼합물을 5mL 폴리스티렌 튜브로 옮긴 후, 1mL 표시선까지 희석합니다. 그다지 현탁된 세포 1mL당 50µL의 쥐 혈청을 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 배양하는 동안 성분 A 25µL와 성분 B 25µL를 혼합하여 선택 칵테일을 준비합니다. 5분이 경과하면 세포에 선택 칵테일 50µL를 첨가하고 실온에서 5분 더 배양합니다.

마이크로비즈를 45초 동안 볼텍싱합니다. 그 다음, 샘플 1 mL당 80 µL의 마이크로비즈를 첨가하고 실온에서 3분 동안 배양합니다. 이어서, 폴리스티렌 튜브의 2.5 mL 표선까지 권장 배지를 첨가합니다.

튜브를 자석 홀더에 넣고 상온에서 3분 동안 둡니다. 배양 후, 자석에 거치되어 있는 15-milliliter 폴리스티렌 튜브에 배지를 천천히 따라냅니다. 자성 분리를 3회 더 반복하며, 매회 권장 배지를 2.5 milliliter 표시선까지 추가합니다.

마지막 자성 분리 후, 성장 배지 3 mL를 첨가하고 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 처리를 위해 poly-D-lysine이 코팅된 플레이트에 세포를 분주합니다. 주로 성상교세포를 포함하고 있는 15 mL 튜브의 음성 분획은 T75 플라스크에 분주합니다.

37°C 배양기에서 최소 6시간 동안 배양한 후, 음성 분획(negative fraction)이 포함된 플라스크의 모든 성장 배지를 교체하고 다시 배양기에 넣습니다. 이 이미지는 녹색 채널에서 미세아교세포 마커인 IBA를, 적색 채널에서 성상교세포 마커인 GFAP를 탐지하여 분리된 미세아교세포 배양물을 면역세포화학 염색한 결과입니다. Hoechst 염색은 세포핵의 존재를 나타냅니다.

GFAP 양성 세포가 관찰되지 않는 것은 CD11b 양성 선택 키트를 사용하여 분리한 미세아교세포 또한 높은 순도를 가짐을 보여줍니다. 분리된 미세아교세포 배양물에서 얻은 이 면역블롯 단백질들을 GFAP(약 51-kilodalton 밴드로 나타남)와 IBA1(약 15-kilodalton 밴드로 나타남)에 대해 분석하였습니다. Beta-actin은 로딩 컨트롤로 사용되었으며 약 42-kilodaltons에서 나타납니다.

기존의 분리 키트의 문제점은 여기에서 보는 바와 같이 적색 채널에서 PE 형광이 관찰될 수 있다는 점이었습니다. 수정된 절차는 여기 적색 채널에서 보이는 것처럼 자성 비드로부터 어떠한 자가 형광도 생성하지 않습니다. 이 절차를 사용하여 분리한 미세아교세포는 신호 전달 연구에 사용할 수 있습니다.

Western blot 분석 결과, 새롭게 개선된 방법으로 분리한 미세아교세포에서 Fyn 및 phospho-src tyrosine Y416을 검출할 수 있음을 보여줍니다. 미세아교세포 분리 과정에서 얻은 음성 분획에는 신호 전달 연구에 사용할 수 있는 별아교세포가 포함되어 있습니다. Western blot 분석을 통해 이 음성 분획에 GFAP 양성 세포가 포함되어 있음을 확인하였습니다.

Western blot 분석 결과, GFAP 양성 세포에서 Fyn 및 phospho-src tyrosine Y416이 검출될 수 있음을 보여줍니다. 이 절차 이후에 다채널 형광 현미경 검사, western blotting, 정량적 PCR과 같은 다른 방법들을 수행하여 유전자 발현 및 단백질 신호 전달에 관한 의문점을 해결할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 미세아교세포 실험을 위해 이 신속 분리 기술을 활용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.