표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

이 간단하면서도 효과적인 절차의 전반적인 목표는 자기 나노입자를 사용하여 인간 말초 혈액에서 희귀 항원 결합 B 세포를 분리 및 농축함으로써 이들의 표현형 및 기능적 분석을 수행하는 것입니다. 이 방법은 생체 내 항원 접촉 전후의 희귀 항원 결합 B 세포의 표현형 및 생물학에 관한 면역학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특히 스티렌 플레이트나 큰 비드를 사용할 때 발생하는 기하학적 구조와 관련된 문제들을 해결할 수 있다는 점입니다.

또한 이는 상당히 큰 초기 세포 집단에서 희귀 세포를 분리하기 위해 유세포 분석법으로 세포를 분리할 때 발생하는 유속 관련 문제를 해결해 줍니다. 헤파린 처리된 혈액 채취 튜브에 전혈 30~50 milliliters를 수집한 직후, 혈액을 멸균된 상온의 마그네슘 및 칼슘 무첨가 PBS와 1:1 비율로 혼합하십시오. 다음으로, 천천히 일정하게 피펫 트리거 압력을 가하여 멸균된 50 milliliter 원추형 튜브에 담긴 10 milliliters의 상온 밀도 구배 용액 위에 혈액 혼합물을 층이 지게 얹으십시오.

원심분리를 통해 세포를 분리합니다. 혈장과 혈소판이 포함된 상층액은 제거하고, 멸균 피펫을 사용하여 단핵구 세포 컨테이너의 버피코트(buffy coat)를 새로운 멸균 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 단핵구 세포를 원심분리하여 세척하기 위해 튜브에 최대 50 milliliters의 PBS를 채웁니다.

그런 다음, 세포 수를 세기 위해 펠렛을 10 milliliters의 신선한 PBS에 재현탁하고, 얼음 위에서 신선한 PBS를 사용하여 세포 농도가 1x10^7 cells per milliliter가 되도록 재현탁합니다. 자성 비드 결합을 위해 세포를 염색하려면, 먼저 각 형광 보정 및 Fluorescence Minus One 대조군에 맞게 1-2x10^6 cell 분량을 5 milliliter 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 남은 세포 샘플을 원심분리하여 수집하고 펠렛을 멸균 여과된 차가운 FACS buffer에 3-6x10^7 cells per milliliter 농도로 재현탁합니다.

세포 용액을 얼음 위에서 4개의 FACS 튜브에 동일하게 분주하고, 4개의 실험 샘플 분획에 human Fcgamma receptor blocking reagant를 첨가합니다. 비특이적 결합 차단 배양 단계가 끝나면, 4개 샘플 분획의 모든 세포에 적절한 형광 표지 세포 표면 염색 항체를 첨가합니다. 그 다음, 분획 A와 D에 적합한 비오틴화 항원을 첨가하고, 이어 분획 B에는 최소 1x10^6 molar의 친화력을 가진 수용체의 대부분이 차단될 수 있도록 충분한 양의 비표지 항원을 첨가합니다.

모든 시료를 얼음 위에서 30분 동안 배양한 후, 분획 B를 적절한 비오틴화 항원과 함께 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면, 5x10^7 세포당 1mL의 차가운 FACS 버퍼로 세포를 2회 세척합니다. 그 다음, 5x10^7 세포당 1mL의 2% formaldehyde에 펠릿을 재현탁하여 얼음 위 암소에서 5분 동안 둡니다.

고정 후, 방금 시연한 것과 동일하게 세포를 두 번 더 세척합니다. 그리고 5x10^7 cells당 1mL의 신선한 얼음 cold FACS buffer로 펠렛을 재현탁합니다. 그런 다음 적절한 secondary Streptavidin Conjugated Antibody 1~2µg을 사용하여 세포를 암소 상태의 얼음 위에서 20분 동안 표지하고, 세포를 두 번 더 세척합니다.

자기 나노입자 기반 농축을 위해, 5x10^7 cells당 1 mL의 차가운 Separation Buffer로 A, B, C 세포 분획을 재현탁하고, 각 세포를 개별 40 µL 스트레이너로 여과하여 덩어리를 제거합니다. 다음으로, 회전 상태에서 4 °C 암실 조건으로 10분 동안 적정 농도의 형광 염료 나노입자를 첨가하고, 샘플을 1 mL의 차가운 Separation Buffer로 2회 세척합니다. 펠렛을 5x10^7 cells당 1 mL의 차가운 Separation Buffer에 재현탁합니다.

그 다음, 세 개의 자성 컬럼을 적절한 크기의 자석 위에 놓고 각각 3 mL의 분리 버퍼(Separation Buffer)로 평형화하며, 분리 버퍼의 전체 부피가 각 컬럼을 통과하여 폐기물 용기로 흐르게 합니다. 이제 각 컬럼 아래에 라벨이 부착된 15 mL 원추형 튜브를 하나씩 배치하고, 자성 입자가 표지된 세포를 각각의 컬럼에 첨가합니다. 각 세포 분획의 전체 부피가 컬럼을 모두 통과하면, 각 컬럼 상단에 3 mL의 신선한 얼음 냉각 분리 버퍼를 추가하고 유출액을 라벨된 튜브에 수집합니다.

두 번째 세척액이 컬럼을 통해 완전히 빠져나간 후, 각 분획의 음성 선택 세포가 담긴 튜브를 얼음 위에 두고 컬럼을 각 분획용 새 15 milliliter 튜브로 옮깁니다. 각 컬럼에 약 6 milliliter의 신선한 Separation Buffer를 채우고, 즉시 버퍼를 컬럼 아래로 밀어내어 자석으로 결합된 세포를 수집합니다. 그 후 원심분리를 통해 양성 및 음성 세포 분획을 모두 수집하고, 펠렛을 계획된 다운스트림 분석에 적합한 용액에 재현탁합니다.

이 그래프들에서, 파상풍 백신 접종 후 10년 이상이 지난 개인으로부터 얻은 파상풍 톡소이드 반응성 B 세포의 빈도는 약 4%의 순도로 파상풍 톡소이드 결합 세포를 약 7배 농축할 수 있는 이 방법의 능력을 보여줍니다. 채혈 약 3년 전에 백신 접종을 받은 피험자의 세포에 50배 과량의 비표지 파상풍 톡소이드를 추가했을 때, 비오틴화 항원을 추가하기 전 파상풍 톡소이드 결합이 83% 감소하여 항원 결합의 특이성을 입증하였습니다. 절차에서 비오틴화 항원을 제외했을 때, B 세포의 0.2%만이 여전히 결합하였으며, 이는 아마도 흡착제 내의 일부 비파상풍 항원 결합을 반영하는 것으로 보입니다.

이 그래프들은 건강한 피험자의 부스터 접종 7일 후 채혈한 혈액 샘플에서 파상풍 톡소이드 특이적 나이브 B 세포의 빈도가 접종 후 84%에서 64%로 감소하는 양상을 보여줍니다. 반면, 메모리 B 세포와 형질모세포 집단의 비율은 각각 16%에서 36%로, 0%에서 40%로 증가합니다. 또한, 건강한 피험자의 부스터 접종 7일 후 말초혈액 샘플에서 얻은 대표적인 ELISPOT 데이터는 분리된 파상풍 톡소이드 결합 B 세포에서 파상풍 톡소이드 항체 분비 세포의 빈도가 4배 농축되었음을 보여줍니다.

이 기술을 숙달하면 적절한 모든 대조군을 포함하여 약 3~4시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 방법은 2차 분석과 결합할 수 있으며, 예를 들어 세포 운명 및 기능의 후속 연구를 위해 세포를 채택된 수용체로 전이시키는 작업 등이 가능합니다. 이 영상을 시청한 후에는 적절한 대조군을 사용하여 인간 말초혈액에서 희귀 항원 결합 B 세포를 분리하고 농축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.