광 반응성 고분자 나노 캐리어로부터의 siRNA 방출의 시공간 조절을 통한 유전자 침묵 예측

이 방법들의 전반적인 목표는 소형 간섭 RNA(small interfering RNA) 매개 유전자 침묵 효율의 예측을 가능하게 하고, 그 결과로 나타나는 단백질 발현 수준을 시공간적으로 제어할 수 있도록 돕는 것입니다. 이 방법은 구조-기능 관계 및 자극 반응성 전달체에 대해 규명할 수 있습니다. 결합과 방출에 대한 제어 능력을 향상시키면, 중개 가능한 플랫폼과 약물 발견뿐만 아니라 재생 의학 기술을 실현할 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 siRNA 방출 분석 및 속도론적 모델링이라는 단순한 기초를 통해 유전자 발현의 변화를 제어하고 예측할 수 있다는 점입니다. 이러한 방법들은 새로운 광응답성 폴리머를 사용하지만, 이 분석 세트는 다른 다양한 자극 응답성 시스템을 테스트하는 데 쉽게 적용될 수 있습니다. 먼저, pH 6의 20 µM HEPES 용액에 siRNA를 첨가하여 32 µg/mL siRNA 용액을 준비하십시오.

그 다음, pH 6의 20 millimolar HEPES 용액에 용해된 mPEG block polyAPN BMA 폴리머를 첨가하여 폴리머 용액을 준비합니다. 농도를 220 micrograms per milliliter로 맞추며, 이 농도에서 N 대 P 비율은 4가 되어 폴리머의 아민기 수가 siRNA의 인산기 수보다 4배 더 많게 됩니다. 이어서, 볼텍스 믹서로 부드럽게 혼합하면서 폴리머 용액을 동일한 부피의 siRNA 용액에 한 방울씩 첨가합니다.

폴리머를 첨가한 후 30초 동안 계속해서 볼텍싱합니다. 그런 다음, 샘플을 실온의 암소에서 30분 동안 배양합니다. 볼텍스 믹서에서 부드럽게 혼합하면서 각 나노캐리어 용액에 STS 용액을 한 방울씩 첨가합니다.

SDS 첨가 후 30초 동안 계속해서 볼텍싱합니다. 샘플을 3,000 Gs에서 5초 동안 원심분리한 다음, 실온의 암소에서 30분 동안 배양합니다. 365 nm 필터가 장착된 UV 레이저를 200 W/m²의 강도로 보정하여 설정합니다.

다음으로, 고무 가스켓에 구멍을 뚫은 후 세척하여 건조시킨 유리 슬라이드 위에 고무 가스켓을 배치합니다. 고무 가스켓의 구멍 내부, 유리 슬라이드 위에 나노캐리어 SDS 용액을 피펫으로 분주합니다. 이때 고무 가스켓에 닿지 않도록 주의하면서 유리 슬라이드 위에 용액을 충분히 로딩합니다.

두 번째 유리 슬라이드를 슬라이드 가스켓 위에 놓습니다. 기포 발생을 방지하기 위해 슬라이드의 한쪽 끝을 먼저 내려놓은 다음, 반대쪽 끝을 천천히 내립니다. 유리 챔버의 양쪽에 바인더 클립을 부착하여 단단히 고정합니다.

365 nanometer 필터가 장착된 UV 레이저를 사용하여 200 watts per square meter의 강도로 원하는 시간 동안 샘플을 조사합니다. 바인더 클립을 제거하고 챔버를 엽니다. 그다음, 조사된 나노캐리어 SDS 샘플 25 microliters를 마이크로 원심분리 튜브에 피펫팅합니다.

용액을 상온의 암소에서 30분 동안 배양합니다. 각 나노운반체 SDS 샘플 25 µL에 로딩 버퍼 용액 5 µL를 첨가합니다. 샘플을 상온의 암소에서 10분 동안 배양합니다.

그 다음, ethidium bromide로 사전 염색된 2% agarose gel에 각 나노캐리어 SDS 샘플 30 µL를 로딩합니다. 암실에서 100 V로 30분 동안 전기영동을 수행합니다. ethidium bromide 필터가 장착된 젤 이미지 분석 시스템을 사용하여 젤의 이미지를 촬영합니다.

겔 이미지 파일을 저장하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 밴드 강도 정량화를 진행하십시오. 양면 접착 스페이서에서 종이 조각을 제거하여 접착면을 노출시킵니다. 스페이서를 유리 커버슬립에 부착하십시오.

나노캐리어 SDS 용액을 커버슬립 위에 피펫으로 분주합니다. 그런 다음, 접착성 스페이서의 구멍이 샘플의 중앙에 오도록 하여 세척된 유리 슬라이드를 커버슬립 위에 놓습니다. 유리 슬라이드를 눌러 유리 슬라이드와 커버슬립이 잘 밀착되어 밀봉되었는지 확인합니다.

FCS 측정을 위해 수치구경(numerical aperture)이 1.2인 40배 수침 아포크로마트(aperchromal) 대물렌즈가 장착된 공초점 현미경을 사용하십시오. 적절한 들뜸 레이저 채널을 사용하여 샘플당 10초씩 최소 30회의 측정을 수행하십시오. 그런 다음, 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 FCS에서 얻은 siRNA 방출 데이터를 속도론적 모델(kinetic model)에 입력하여 유전자 침묵 반응을 예측하십시오.

in-vitro siRNA 전달을 준비하려면, 먼저 6-웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 2 mL를 추가합니다. 인큐베이터에서 24시간 동안 세포를 부착시키고 회복시킵니다. 인산염 완충 식염수로 세포를 세척한 후, 혈청 및 항생제가 없는 형질전환 배지 1.5 mL를 추가하여 형질전환을 준비합니다.

다음으로, 30 picomoles의 siRNA가 포함된 나노캐리어 용액 25 microliters를 각 웰에 추가합니다. 배지를 부드럽게 파이펫팅하여 혼합합니다. 세포를 인큐베이터에 3시간 동안 둡니다.

형질도입 배지를 제거하고 각 웰을 PBS로 세척합니다. 그런 다음, 보충된 성장 배지 1 mL를 첨가하고 세포를 인큐베이터에 넣어 30분 동안 회복시킵니다. 광자극 처리를 위해 세포를 준비하려면 보충된 성장 배지를 제거합니다.

그 다음, 각 웰에 transvection medium 1 mL를 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 UV 레이저를 보정한 후, 세포를 37 °C로 설정된 핫플레이트에 놓습니다. 6-웰 플레이트에서 커버를 제거합니다.

365 nm 필터가 장착된 UV 레이저를 사용하여 200 W/m²의 강도로 플레이트 상단에서 원하는 시간 동안 세포를 조사합니다. 트랜스펙션 배지를 제거하고 2 mL의 보충 성장 배지를 첨가합니다. 이후 분석 시까지 세포를 인큐베이터에 보관합니다.

365 nanometer 빛을 완전히 차단하고 반사를 최소화하는 포토마스크를 준비하려면, 먼저 포토마스크를 원하는 모양으로 절단, 펀칭 및/또는 가공하십시오. 패턴이 세포가 포함된 웰의 중앙에 오도록 하고, 반사 방지 면이 플레이트를 향하게 하여 포토마스크를 6-웰 플레이트 바닥에 접착하십시오. 두 개의 링 스탠드를 약 25 meters 간격으로 설치하고, 각 링 스탠드에 플랫폼을 부착하여 플랫폼의 높이가 동일하게 맞추십시오.

두 스탠드 위에 플레이트를 올려놓아 셀 플레이트를 고정합니다. 365 nanometer 필터가 장착된 UV 레이저를 사용하여, 200 watts per square meter의 강도로 샘플 하단에서 원하는 시간 동안 세포를 조사합니다. 형질전환 배지를 제거하고 2 mL의 보충 성장 배지를 첨가합니다.

그런 다음, 세포를 인큐베이터에 넣고 최소 24시간 동안 회복시킵니다. 앞서 설명한 대로 형광 현미경을 사용하여 세포를 이미징합니다. 여기 제시된 내용은 유전자 साइ런싱 역학의 간단한 키네틱 모델링 예시입니다.

광유도 siRNA 방출 후 시간에 따른 mRNA, 단백질 및 siRNA 농도를 예측하기 위해 모델을 실행하였습니다. 다양한 광량에 따라 방출된 siRNA의 상대적 양을 키네틱 모델의 초기 siRNA 농도로 입력하였습니다. 그 결과, 단백질 발현 수준에 대한 모델 예측값은 웨스턴 블로팅을 통해 실험적으로 결정된 발현 수준과 일치하였습니다.

시각화를 위해 GFP 발현 세포에 GFP 표적 siRNA를 처리하였으며, 조사 전 플레이트 위에 환형 포토마스크를 배치하여 원형 패턴을 형성하였습니다. 빛으로부터 보호된 세포들은 siRNA와 빛을 처리하지 않은 대조군 샘플과 구별되지 않는 형광 강도를 보였습니다. 반면, 원형 패턴 내부의 거의 모든 세포는 GFP 발현이 나타나지 않았으며, 이는 siRNA가 효율적으로 방출되어 유전자 녹다운이 이루어졌음을 나타냅니다.

또한, 빛의 사용은 세포 수준의 규모에서 제어 가능한 유전자 발현 트리거로 작용합니다. 요약하자면, 이 방법은 siRNA 방출을 시공간적으로 조절하고 유전자 침묵을 사전에 예측하기 위한 조사 조건을 빠르게 결정할 수 있게 합니다. 이 프로토콜을 적용하면 나노운반체의 안정성과 효능을 결정하는 구조-기능 관계를 규명하는 데 도움이 될 것입니다.

이 기술은 유전자 발현의 시공간적 제어가 필요한 재생 의학 분야의 응용을 가능하게 할 수 있습니다. 또한, 이러한 제형은 피부암과 같은 국소 질환뿐만 아니라 피부과 질환의 치료에도 매우 적합합니다.