간염 E 바이러스 나노 화학 활용 방법을 사용 하 여의 표면 기능화

HEV 나노입자 표면의 화학적 기능화의 전반적인 목적은 진단 및 치료 목적으로 표적 면역원성, 치료 및 진단 분자를 HEV 나노입자 표면에 접합시키기 위한 재현 가능하고 일관된 접근 방식을 제공하는 것입니다.

이 방법은 암 표적화 강화 및 나노 치료제의 분포를 어떻게 모니터링할 수 있는지와 같은 나노 의학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전자 공학을 이용한 방법과 비교했을 때 재현성이 높고 효율적이며 훨씬 더 쉽게 구현할 수 있다는 점입니다.

시연을 진행할 분들은 저희 실험실의 연구 보조원인 Michelle Nguyen과 Ivan Ruiz입니다.

본 프로토콜을 시작하기 전, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 E형 간염 바이러스 나노입자의 생산 및 정제를 수행하십시오.

TEM 이미징을 위해 HEV 나노입자 샘플을 10 mM MES(pH 6.2)를 사용하여 0.5~2 mg/mL 농도로 희석합니다. 친수성 탄소 표면을 형성하기 위해 탄소 코팅 그리드를 40 mA 글로우 방전으로 30초 동안 이온화합니다. 그리드의 친수성 탄소 표면은 글로우 방전 처리 후 30분 동안만 유지됩니다. 이온화 후, 그리드와 핀셋을 잡고 2 µL의 HEV 나노입자 샘플을 그리드에 첨가합니다.

15초에서 30초 후, 필터 페이퍼로 그리드를 닦아냅니다. 그 다음 즉시 이중 증류수로 그리드를 세척하고 필터 페이퍼로 다시 닦아냅니다. 즉시 2% 우라닐 아세테이트 2 µL를 그리드에 첨가합니다. 15초 후, 필터 페이퍼로 그리드를 닦아냅니다. 샘플 그리드를 전자 제습 건조기에 넣어 하룻밤 동안 건조합니다.

샘플에 따라 구조 시각화 및 특성 분석을 위해 저온 전자 현미경(cryogenic electron microscopy) 또는 cryo-EM이 필요할 수 있습니다. 그리드를 TEM으로 옮겨 10에서 80K 배율로 촬영하십시오. HEV 나노입자는 바이러스 RNA가 없기 때문에 TEM 상에서 직경이 약 27 nanometers인 빈 정이십면체 단백질로 나타납니다.

HEV 나노입자와 maleimide-linked biotin의 원스텝 결합(one-step conjugation)을 수행하려면, 먼저 HEV 나노입자를 미니 투석 유닛에 넣습니다. 제조사의 프로토콜에 따라 실온에서 0.01 molar PBS pH 7.4를 사용하여 나노입자를 1시간 동안 투석합니다. 투석 후, HEV 나노입자를 1.5 milliliter 튜브로 옮기고 분광광도계를 사용하여 280 nanometers에서 단백질 농도를 측정합니다. 1 mg/mL 농도의 나노입자를 100 micromolar maleimide-biotin 및 0.01 molar PBS pH 7.4와 동일한 양으로 혼합하여 1:5 몰 비율로 만듭니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 반응시킨 후, 제조사의 프로토콜에 따라 스핀 탈염 컬럼(spin desalting column) 절차를 통해 결합되지 않은 maleimide biotin을 제거합니다. 표준 환원성 SDS page를 통해 샘플을 분석합니다.

표준 절차에 따라 HRP가 결합된 streptavidin을 사용하여 화학발광 Western blot을 준비하고, X-ray 필름으로 화학발광 신호를 캡처하십시오.

유방암 세포 특이적 리간드인 LXY30을 HEV 나노입자의 표면에 노출된 시스테인에 2단계로 접합하려면, 먼저 나노입자를 미니 투석 장치에 넣고 상온에서 0.01 M PBS pH 7.4를 사용하여 1시간 동안 투석합니다. 그다음 HEV 나노입자를 1.5 mL 튜브로 옮기고 분광광도계를 사용하여 280 nm에서 단백질 농도를 측정합니다. 이어서 650 µM maleimide-azide와 650 µM alkyne-LXY30을 200 µM 황산구리와 1 mM 아스코르브산과 함께 혼합합니다. 이렇게 하면 650 µM 농도의 maleimide-linked-LXY-30이 형성됩니다. 이 혼합물을 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 1 mg/mL 농도의 HEV 나노입자에 maleimide-linked LXY30을 약 10% 부피로 혼합하여 1:3 몰비를 맞춥니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 반응시킵니다. maleimide LXY30의 농도가 상대적으로 높기 때문에, 혼합 후 황산구리와 같은 반응물의 최종 농도는 약 10배 감소합니다. C형 간염 바이러스 나노입자의 손상을 방지하기 위한 또 다른 방법으로는 구리 프리 접합법(copper free contribution method)이 있습니다.

제조사의 프로토콜에 따라 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 결합되지 않은 maleimide click LXY30을 제거합니다. LXY30이 연결된 HEV 나노입자는 4 °C에서 보관하십시오. LXY30 HEV 나노입자와 Cy5.5 형광 태그의 단일 단계 접합을 수행하려면, 먼저 1 mg/mL 농도의 LXY30 연결 나노입자와 동일한 부피의 Cy5.5 형광 태그를 혼합하여 1:5 몰비를 맞춥니다. 혼합물을 4 °C에서 하룻밤 동안 반응시킨 후, 제조사의 프로토콜에 따라 스핀 탈염 컬럼 절차로 결합되지 않은 Cy5.5 NHS를 제거합니다. LXY30 Cy5.5 연결 HEV 나노입자는 4 °C에서 보관하십시오.

종양 세포 타겟팅을 위한 HEV 나노입자의 LXY30 기능화를 위해 두 가지 방법을 시도하였다. HEV 573C 나노입자를 먼저 maleimide azide에 결합시킨 후 LXY30 alkyne과 클릭 화학 반응을 진행했을 때, TEM 관찰 결과 HEV 573C 나노입자가 분해되는 것으로 나타났다. 반면, LXY30-alkyne과 maleimide-azide 사이의 클릭 화학 반응을 먼저 수행하여 maleimide-linked LXY30을 형성한 후, 이를 assist 변형 HEV 나노입자에 접합시킨 경우에는 구조에 영향을 주지 않았으며 HEV 573C 나노입자가 온전하게 유지되었다. LXY30 및 Cy5.5-linked HEV 나노입자를 배양된 유방암 세포에 적용하고 공초점 현미경으로 관찰하였다. 공초점 현미경을 이용한 근적외선 형광 이미지 결과, LXY30 Cy5.5-linked HEV 나노입자는 Cy5.5-linked HEV 나노입자에 비해 MDA MB-231 유방암 세포에 대해 더 높은 결합 친화력을 보여 세포 내 섭취가 증가했음을 나타냈다.

이 기술의 함의는 정상 세포에 손상을 주지 않으면서 종양을 정확하게 표적화하고 진단할 수 있게 하는 다중 모드 표적 및 치료 분자의 연구로 확장됩니다. 이 방법은 화학적 표면 조절을 통해 암 및 종양 표적화에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 조기 암 진단, 스크리닝 및 영상 유도 치료에 적용될 수 있습니다.