설치류의 혈액 뇌 장벽 개방을 위한 고처리량 이미지 유도 입체 신경 탐색 및 집중 초음파 시스템

미만성 내인성 폰틴 신경교종(diffused ininsic pontine glioma)과 같은 고급 신경교종은 사망률이 높은 고도의 침습성 종양입니다. 수년간의 광범위한 연구에도 불구하고 화학 요법은 뇌에 효과적으로 도달할 수 없기 때문에 혈액 뇌 장벽이 중요한 측면입니다. 다행히도 집속 초음파는 효과적인 치료를 위해 혈액-뇌 장벽을 일시적 및 국소적으로 열 수 있습니다.

우리는 혈액-뇌장벽 파괴를 위한 작고 비용 효율적인 신경 탐색 집속 초음파 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 상업적으로 이용 가능한 구성 요소로 구축되었으며 높은 수준의 자동화를 통해 전임상 약물 평가 연구를 수행할 수 있습니다. 정밀 의학은 적시에 적절한 환자에게 적절한 용량으로 올바른 약물을 투여하는 것으로 정의됩니다.

이를 위해서는 사전 선택된 많은 약물을 스크리닝해야 합니다. 혈액-뇌 장벽 파괴를 위한 당사의 소형 고처리량 집속 초음파 시스템을 사용하면 바로 이를 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구 그룹의 박사 과정 학생인 Rianne Haumann과 Elvin t Hart입니다.

이미지 유도 정위 신경 항법 집중 초음파를 위한 워크플로우에는 초음파 플랫폼에서 초음파 처리를 위한 중재적 이미징 및 음향 결합이 포함됩니다. 그 후, 후속 이미징을 수행할 수 있습니다. 설계된 실험의 요구 사항에 따라 적합한 변환기를 선택하십시오.

탈기된 물로 채워진 3D 프린팅 원뿔에 넣고 음향적으로 투명한 Mylar 멤브레인으로 바닥을 닫습니다. 변환기를 함수 발생기와 전력 증폭기에 연결합니다. 자동 수직 위치 지정을 위해 트랜스듀서를 전동 선형 스테이지에 장착하고 파워 앰프에 연결합니다.

온도 조절 가열, 바이트 및 이어 바, 마취 및 다중 양식 기준 마커를 포함하는 분리 가능한 정위 플랫폼을 사용하십시오. 플랫폼을 2D 선형 스테이지에 부착합니다. FUS 시스템을 사용하기 전에 시스템을 보정하고 변환기의 초점 지점을 결정하십시오.

초점 포인트는 정위 플랫폼에서 동물의 수직 위치에 해당합니다. 도착 후 최소 일주일 동안 동물을 시설에 적응시키고 정기적으로 체중을 측정하십시오. 실험 당일, FUS 치료 30분 전에 피하 주사를 통해 부프레노르핀을 투여합니다.

후 안구 건조를 방지하기 위해 안연고를 바르십시오. 필요한 경우 면도기와 제모 크림으로 동물의 머리 꼭대기에 있는 털을 제거하십시오. 물로 피부를 씻어 잔여물을 제거하십시오.

BLI 종양 모델을 사용한 실험의 경우, 29 게이지 인슐린 주사기를 150 마이크로리터의 D-루시페린을 복강내 주사합니다. BBB 개구를 위한 미세기포를 투여하려면 26-30 게이지 꼬리 정맥 카테터를 삽입하고 소량의 헤파린 용액으로 정맥을 세척합니다. 카테터가 분리되지 않도록 티슈 테이프로 고정하십시오.

카테터 삽입이 성공적으로 완료되면 카테터에 헤파린 용액을 채워 혈액 응고를 방지합니다. 저체온증을 피하기 위해 온도가 조절되는 정위 플랫폼에 동물을 놓습니다. 바이트 바와 이어 바를 사용하여 동물의 머리를 고정하고 꼬리와 카테터를 플랫폼에 테이프로 붙입니다.

스트랩으로 마우스 본체를 고정합니다. 이미징 양식에 장착된 마우스가 있는 정위 플랫폼을 놓고 동물의 이미지를 촬영합니다. 동물이 플랫폼에 올바르게 놓였는지 확인합니다.

트랜스듀서의 초점점에 따라 이미지 처리 파이프라인과 함께 다중 양식 기준 마커를 사용하여 동물의 위치를 표시합니다. 획득한 X-ray 이미지 위에 뇌 윤곽을 배치하거나 BLI 이미지를 사용하여 종양의 중심을 결정하여 대상 영역을 결정합니다. 변환기를 배치하기 전에 초음파 젤이 호흡을 방해하지 않도록 테이프로 동물의 콧구멍과 입을 보호하십시오.

적절한 소리 전달을 위해 마우스 머리 위에 초음파 젤을 바르십시오. 후두골 바로 근처에 놓인 바늘 수중청음기로 미세 기포 캐비테이션을 기록합니다. 보정 값에 따라 변환기를 동물 위의 올바른 위치로 안내합니다.

관심 있는 뇌 영역을 대상으로 하기 위해 연결된 모든 장치에 사전 구성된 설정을 적용합니다. 변환기를 올바른 위치에 놓은 후 제조업체에서 설명한 대로 미세 기포를 용해하고 활성화합니다. 마이크로 버블 주입 전에 꼬리 정맥 카테터를 식염수로 세척하여 꼬리 정맥 접근을 확인합니다.

insonication 궤적을 시작하고 동시에 microbubbles를 주입합니다. 동시에 바늘 수중 청음기는 실시간으로 미세 기포 캐비테이션을 감지하고 확인합니다. 원하는 경우, 초음파 검사 후 혈관 내 조영제 또는 약물을 투여하십시오.

미리 결정된 시점까지 동물을 모니터링합니다. 마이크로버블과 결합된 0.4의 기계적 지수를 가진 음압은 마이크로버블이 주입되지 않았을 때 저고조파가 감지되지 않거나 0.6의 MI가 적용되었을 때 관성 캐비테이션 관찰에 비해 매우 민감하고 신뢰할 수 있는 안정적인 캐비테이션 감지 수단을 제공했습니다. MI가 최대 0.6인 음압에서는 거시적 손상이 발생하지 않았지만 미시적 손상은 0.6의 MI에서 조직학적으로 입증되었습니다.

MI가 0.8인 압력 진폭은 더 큰 혈관의 거시적 뇌출혈과 적혈구의 유출과 함께 광범위한 조직 용해를 초래했습니다. 폰틴 영역에서 BBB의 개방을 확인하기 위해 Evans blue를 정맥 주사했습니다. FUS와 마이크로버블로 처리된 마우스의 폰스(pons)와 소뇌(cerebellum) 수준에서 Evans blue conjugated albumin의 유출이 관찰되었으며, 이는 관심 영역의 정확한 표적화를 입증했습니다.

이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 꼬리 정맥 카테터의 올바른 배치, 동물의 위치 지정 및 표적화, 캐비테이션 감지와 함께 집속 초음파를 사용한 마이크로 버블 주입입니다. 이 자체 제작 집속 초음파 시스템은 여러 연구 질문에 맞게 조정 및 재설계할 수 있으며, 이는 비용 효율적이고 자동화된 작업 흐름을 갖추고 있어 상대적으로 경험이 부족한 연구자에게 적합합니다.