유동 세포에 의한 주요 조직 적합성 복합 클래스 1의 표현 평가

이 프로토콜은 유세포 분석을 사용하여 마우스에서 배양된 1차 뉴런에서 세포 외 MHC 클래스 1 발현을 정량적으로 평가합니다. MHC1 발현을 위한 NC2 면역염색은 단백질, 3차, 구조적 변화, 투과화 또는 변성 조건으로 인한 신호 손실을 방지하기 위해 수행할 수도 있습니다. 감염에 대한 면역 반응을 지시하는 것 외에도 MHC 클래스 1은 뉴런 시냅스 연결을 조절합니다.

그러나 MHC 클래스 1 발현을 조절하는 요인은 아직 알려져 있지 않습니다. 배아 뇌 해부 단계는 숙달하기 위해 연습이 필요합니다. 기술을 배울 때 시간이나 후속 배양 과정에 대해 걱정하지 않고 해부 연습에 주의하십시오.

배아 해마를 분리하기 위해, 최초로 적출된 쥐 배아 뇌를 실체 해부 현미경 아래에 놓습니다. 그리고 두 쌍의 Sterile Dumont number 5 집게를 사용하여 후각구를 집어 넣고 수막을 완전히 제거합니다. 수막이 완전히 제거되면 피질의 상측이 측면으로 열려 해마가 노출됩니다.

겸자를 사용하여 부착된 피질에서 해마를 집어 분리하고 격리된 해마를 얼음 위에 5ml의 Hibernate-E Medium이 들어 있는 멸균 15ml 원추형 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 모든 해마가 15밀리리터 튜브 하나에 모이면 원심분리로 뇌 조직을 침전합니다. 상층액을 배아당 0.5ml의 갓 준비된 파파인 해리로 교체하고 튜브를 반전으로 여러 번 혼합합니다.

조직을 섭씨 37도에서 30분 동안 놓고 10분마다 반전으로 샘플을 혼합한 후 원심분리로 조직을 다시 수집합니다. 상층액을 동일한 부피의 새로운 Hibernate-E Medium으로 교체하고 완전히 열린 유리, 화염 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직을 10회 분쇄합니다. 조직을 2분 동안 가라앉힌 후 상층액을 새로운 50ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

동일한 부피의 Hibernate-E Medium을 조직에 다시 추가하고 반쯤 열린 유리 화염 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직을 10회 분쇄합니다. 조직을 2분 더 가라앉힌 후 상층액을 50ml 튜브에 모읍니다. 동일한 부피의 Hibernate-E Medium을 조직에 추가하고 1/4 개방형 유리 화재 광택 파스퇴르 피펫으로 조직을 10 번 분쇄합니다.

조직을 2분 동안 가라앉힌 후 상층액을 50ml 튜브에 모읍니다. 원심분리에 의해 상층액에서 해리된 세포를 수집합니다. 및 펠릿을 계수하기 위해 5 밀리리터의 뉴런 성장 배지에 재현탁시키고, 세포를 뉴런 성장 배지 10의 5배의 최종 도금 밀도로 희석하고, 12-웰 폴리-D-라이신 코팅된 플레이트의 각 웰에 1밀리리터의 세포를 첨가한다.

그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣고 배지의 절반을 배양 수명 동안 일주일에 두 번 동일한 부피의 신선한 배지로 교체합니다. 배양된 뉴런이 MHC1을 발현하는 능력을 평가하기 위해, 적절한 배양 당일에 각 웰에 있는 0.5ml의 상등액을 0.5ml의 새로운 뉴런 성장 배지로 교체하고, 세포 배양 인큐베이터에서 6-72시간 동안 배양하기 위해 밀리리터당 200단위의 인터페론 베타를 보충합니다. 배양이 끝나면 보충제 없이 차가운 Neurobasal Medium으로 각 웰을 한 번 세척한 후 각 웰에 FC 블록 밀리리터당 1마이크로그램과 형광 접합 항MHC1 항체 밀리리터당 1마이크로그램을 첨가한 0.5밀리리터의 비보충 Neurobasal Media를 추가합니다.

섭씨 4도에서 45분 동안 배양한 후 빛으로부터 보호하십시오. 차가운 Dulbeccos PBS로 각 우물을 한 번 씻으십시오. 다음으로, 각 웰에 0.5ml의 실온 효소가 없는 세포 해리 완충액을 추가하고 교반하여 세포를 제거합니다.

도립 조직 배양 현미경에서 해리를 확인하고 각 웰에 0.5ml의 FACS 완충액을 추가합니다. 세포를 분쇄하여 덩어리를 분산시키고 각 웰의 전체 부피를 개별 1.7ml 마이크로 원심분리기 튜브로 전달합니다. 원심분리로 세포를 수집하고 튜브당 100마이크로리터의 새로운 FACS 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.

각 현탁액을 96웰 U-바닥 플레이트의 개별 웰로 옮기고 각 웰에 100마이크로리터의 고착 시약을 추가합니다. 세포 응집을 방지하기 위해 여러 번 분쇄하고 빛으로부터 보호된 실온에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다. 배양이 끝나면 원심분리를 하여 웰 바닥에서 세포를 수집하고 웰당 200마이크로리터의 새로운 FACS 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.

원심분리 후, 웰당 형광 접합 항신경 핵 항체가 보충된 투과화 시약 100마이크로리터에 펠릿을 재현탁합니다. 혼합 후 빛으로부터 보호되는 흔들림으로 실온에서 플레이트를 20분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 원심분리로 세포를 세 번 수집하고, 원심분리 사이에 100마이크로리터의 새로운 FACS 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.

마지막 세척 후, 철저한 혼합으로 FACS 완충액에 100마이크로리터의 2%쌍의 포름알데히드에 세포를 재현탁합니다. 뉴런은 세포 파편과 이중선을 배제하기 위한 전체 이벤트의 순차적 게이팅과 뉴런 핵 양성성을 통해 식별할 수 있습니다. 그런 다음 신경 핵 양성 세포를 MHC1 양성에 대해 추가로 분석할 수 있습니다.

이 데이터에서 MHC1 염색에 양성인 뉴런의 비율과 중앙값 형광 강도를 계산할 수 있으며, 예를 들어 인터페론 베타 처리가 MHC1 뉴런 발현의 비율과 강도를 크게 상향 조절한다는 것을 밝힐 수 있습니다. 약간의 수정을 통해 이러한 방법은 피질 뉴런과 같은 다른 뉴런 집단을 배양하거나 다른 세포 마커, 자극 분자 또는 유전자 변형을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.