인간 종양 세포 및 종양-xenografted 마우스에 있는 매크로 피노세포증에 의해 중재된 ATP 내재화를 위한 형광 현미경 검사법
2021년 6월 30일
우리는 높은 세포 분해능을 가진 ATP 대리인 비수성 아데노신 삼위산염(ATP)의 내재화를 시각화하는 재현 가능한 방법을 개발했습니다. 우리는 독립적인 체외 및 생체 내 분석-인간 종양 세포주 및 면역결핍 마우스 를 사용하여 인간 종양 조직과 이식된 우리의 방법을 검증했습니다.
암세포는 세포 외 환경에서 ATP와 같은 영양소를 내면화하는 놀라운 능력을 가지고 있습니다. 우리의 프로토콜은 ATP 내산화를 입증하고 세포 내에서 ATP 지역화를 시각화 할 수 있습니다. 거형화 내의 내부ATP의 고해상도 이미징은 특수 현지화를 이해하고 내재화 분석 수량을 완료하는 데 이상적입니다.
이 프로토콜은 ATP 내재화를 연구하기 위한 다양한 실험 응용 프로그램을 설명합니다. 이 방법은 거형 세포 세포증 및 엑소좀 매개 내분법을 포함하여 세포 내재화의 다른 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 대사 질환의 경우 비암 세포에서 ATP 내산화를 이 프로토콜로 연구할 수 있습니다.
시작하려면, FBS와 항생제로 보충 DMEM을 포함하는 225 평방 센티미터 플라스크에 암세포를 종자. 세포배양배양에서 세포가 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 성장할 수 있도록 합니다. 일단 80%의 합류가 달성되면, 세포와 펠릿을 원심분리에 의한 분리세포를 분리하고, PBS의 100마이크로리터당 6세포의 5배 10~6세포의 세포 밀도를 달성하기 위해 얼음감기 PBS에서 세포를 재연한다.
세포 현탁액을 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 이송합니다. 면역 결핍 마우스의 측면에 주입 부위를 청소, 75%에탄올, 섬세한 작업 닦아와 여분의 에탄올을 닦아. 27 게이지 정밀 글라이드 바늘이 장착된 1밀리리터 라텍스 프리 주사기로 셀을 그립니다.
피하 주사의 경우 바늘을 피부에 약 10도 각도로 잡고 피부 아래를 향한 벨이 있는 바늘 끝을 삽입하여 피부 바깥쪽에 바늘을 1~2밀리미터만 유지합니다. 주사기에서 세포를 약 10초 이상 천천히 분배합니다. 전체 부피를 주입 한 후 바늘을 3 ~ 5 초 동안 제자리에 고정한 다음 바늘을 철회하십시오.
주입된 내용물의 누출을 방지하기 위해 손가락으로 3~5초 동안 사출 부위에 부드럽지만 단단한 압력을 가하십시오. 종양이 200 ~500 입방 밀리미터의 부피에 도달할 때까지 Vernier 캘리퍼를 사용하여 종양 성장을 모니터링하고 측정합니다. 밀리리터 고분자 중량 형광 덱텐과 세럼이 없는 DMEM당 16밀리그램의 마이크로리터 300마이크로리터를 녹이고, 30분 동안 섭씨 37도에서 강화된 수조에서 배양한 다음, dextran 용액을 원심분리하고 초퍼를 새로운 1.5밀리리터 미세산경선으로 옮기다.
40 마이크로리터에서 1밀리미터 비 가수 분해성 형광 ATP 아날로그 스톡을 160 마이크로리터의 혈청 이없는 DMEM에 공급하여 0.2 밀리머라 비가수분해성 형광 ATP 솔루션을 만듭니다. DMEM의 고분자 또는 저분자량 형광 dextran당 8밀리그램의 치료 솔루션을 DMEM의 100 마이크로몰러 비하이드로졸 형광 ATP의 유무에 관계없이 이전에 제조된 스톡 솔루션을 혼합하여 준비합니다. 1 밀리리터 주사기를 사용하여 하나의 치료 용액 50 마이크로리터를 수집합니다.
xenograft 종양에 직접 용액을 주입하고 각 치료의 4 개의 생물학적 복제를 반복하십시오. 마우스를 안락사시키고 종양 조직을 격리한 후 천공 된 숟가락을 사용하여 절제된 종양 조직을 떠서 즉시 조직을 동결 배지에 넣고 조직을 굴려 조직이 중간 목욕에 잠긴 채로 유지되도록합니다. 조심스럽게 동결 매체를 포함하는 포함 형질에 조직을 배치합니다.
해당 레이블 태그를 고정 매체 또는 몰드에 수직으로 배치하여 작성된 레이블이 매체 외부에 표시되도록 합니다. 동결 배지가 불투명하게 변하면, 금형에서 조직 블록을 제거하고, 조직 블록을 드라이 아이스에 배치하고 각 종양 섹션에 대해 동결을 반복한다. 극저온 절제 절차 전에 몇 달 동안 영하 80도의 티슈 블록을 저장합니다.
조직 블록의 슬라이드를 만든 후, 5 분 동안 영하 18도에서 95 %에탄올로 티슈 섹션 슬라이드를 수정합니다. 고정 된 섹션을 PBS로 5 분 동안 씻으시면됩니다. 단면의 크기에 따라 DAPI를 사용하여 수성 마운팅 배지의 10~50마이크로리터를 조직 섹션에 추가하고, 티슈 섹션 위에 유리 커버 슬립을 놓습니다.
12~24시간 마운팅 후, 고정 종양 섹션의 관심 영역을 식별하고 이전에 설명한 바와 같이 형광 현미경검사를 사용하여 이미지를 습득한다. 인간 종양 세포 고정 및 DAPI와 함께 서 2~ 24 시간 후에, 에피소드 형광 화상 진찰 시스템 및 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 심상을 캡처합니다. 쌍안경 모드에서 직립 상피 현미경의 무대에 슬라이드를 배치합니다.
이미징 프로그램을 열고 10배 의 목표를 선택하고 스테이지를 조정하여 초점을 정의합니다. 슬라이드를 좌측에서 오른쪽으로 스캔하여 관심 영역을 식별합니다. 40배 의 목표를 선택하고 현미경의 토글을 사용하여 쌍안경에서 이미지 캡처 모드로 전환합니다.
라이브 품질 아이콘을 클릭하여 이미지를 보고 나중에 수집합니다. 획득 도구 모음의 OC 패널을 사용하여 각 필터 큐브 또는 형광 채널에 대한 노출 매개 변수를 정의한 다음 멀티 채널 수집 툴바를 사용하여 정의된 노출 설정으로 세 채널 이미지를 획득합니다. 또는 필터 큐브 사이를 전환하고, 노출 시간을 설정하고, 각 채널의 이미지 수집 사이의 셔터를 닫거나 열고, 개별 채널에 대해 촬영한 각 이미지를 오버레이하여 다중 채널 이미지를 수동으로 획득할 수 있습니다.
이미지를 nd2 파일로 저장합니다. 병합된 채널 이미지와 개별 채널 이미지를 포함하여 TIF 파일을 저장합니다. 주석 및 측정 툴바의 개체 수 기능을 사용하여 저장된 nd2 이미지 파일에 NHF-ATP, TMR 고분자중량 형광 드엑스트라및 TMR 저분자량 형광 드엑스트라 포지티브 셀의 수를 계산하고 분석 프로그램을 통해 스프레드시트로 데이터를 내보냅니다.
이 프로토콜은 비수성 ATP의 세포 내산화의 공간, 시간적 및 정량적 분석을 위해 개발되었다. 비수성 형광 ATP의 세포 내산화는 체외, 전 생체 및 생체 내에서 높은 또는 저분자 량 형광 dextran을 가진 비가수분해성 형광 ATP의 공동국화에 의해 입증되었다. 종양 세포가 내재화된 ATP를 유지하도록 하기 위해 모든 종양 내 주입을 위한 제한된 실험 시간이 극저온-임베딩에 있습니다.
또한 종양 전체에 걸쳐 이미징 조직에 의한 종양 내 변이를 설명합니다. 향후 방법의 반복에는 E-ATP 내재화 프로세스의 실시간 시각화가 포함될 수 있으며, 특정 조직에서 거시노세포 역학 및 인신 매매에 대한 정보를 공개할 수 있습니다.
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개요
본 연구는 고해상도 세포 이미징이 가능한 비가수분해성 형광 ATP의 내부화(internalization)를 시각화하기 위한 재현 가능한 방법을 제시합니다. 이 방법은 인간 종양 세포주와 면역결핍 마우스를 이용한 in vitro 및 in vivo 분석을 통해 검증되었습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 세포 생물학
- 암 연구
- 이미징 기술
배경
- 암세포는 주변 환경으로부터 ATP와 같은 영양분을 세포 내로 흡수할 수 있습니다.
- 세포 내 ATP 위치를 이해하는 것은 대사 과정을 연구하는 데 매우 중요합니다.
- 세포 메커니즘을 분석하기 위해서는 고해상도 이미징 기술이 필수적입니다.
- 본 프로토콜은 암세포와 비암세포 모두에 적용할 수 있습니다.
연구 목적
- 암세포 내 ATP 내재화를 입증함.
- 세포 내 ATP 위치를 시각화함.
- 다양한 세포 내재화 메커니즘을 연구하기 위한 방법을 제공함.
사용된 방법
- 내부화된 ATP의 고해상도 이미징.
- ATP 내부화 기전을 연구하기 위한 실험적 응용.
- 인간 종양 세포주를 이용한 인비트로(in vitro) 분석.
- 인간 종양 조직을 이식한 면역결핍 마우스를 이용한 인비보(in vivo) 분석.
주요 결과
- 매크로피노솜 내 ATP 국소화의 성공적인 시각화.
- ATP 내부화 양을 분석하는 능력 입증.
- 다양한 실험 설정에서 해당 방법의 유효성 검증.
- 세포 내부화 메커니즘에 대한 통찰 제공.
결론
- 개발된 방법은 ATP 내재화를 연구하는 데 효과적입니다.
- 이 접근 방식은 암세포의 대사 과정에 대한 이해를 높일 수 있습니다.
- 잠재적인 응용 분야는 비암세포의 대사 질환으로 확장될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
이 방법은 종양 모델에서 대식세포작용(macropinocytosis)을 통한 세포 외 ATP의 내부화(internalization)를 직접 시각화함으로써, 암 세포의 생존 및 대사 적응과 관련된 영양분 포착 경로에 대한 기전적 통찰을 제공합니다. in vitro 및 in vivo 시스템 모두에서 ATP 섭취량을 정량화함으로써, 본 접근 방식은 잠재적 치료 표적인 퓨린성 신호 전달(purinergic signaling) 및 내세포작용 유속(endocytic flux)에 집중한 표적 검증 노력을 지원합니다. 다양한 세포주 및 이종 이식 모델에 적용 가능한 이 프로토콜의 적응성은 종양학 신약 개발을 위한 전임상 리스크 감소 전략에서 그 유용성을 높여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 영양분 섭취 경로에서 표적 결합의 기능적 판독값으로서 대식세포작용(macropinocytosis) 매개 ATP 내부화의 조사를 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: ATP 내부화와 내포 작용 추적물질과의 공국소화(colocalization)에 미치는 화합물의 효과를 평가할 수 있는 정량적 이미징 기반 분석법을 제공합니다.
- 예측적 가치: 세포 외 영양분 포집과 종양 세포의 적응도 및 내성 표현형을 연결함으로써 기전적 위험 제거(de-risking)를 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 비가수분해성 형광 ATP 및 덱스트란 추적자를 사용하여 거대음세포작용(macropinocytosis) 특이적 내부화 이벤스의 검출을 표준화합니다.
- 정량적 결과: 형광 현미경을 통해 내부화된 ATP 양성 세포의 객체 수 기반 분석을 가능하게 하여, 스크리닝 캠페인의 히트 검증에 활용합니다.
- 확장성: 다채널 이미징 및 자동 이미지 분석과 호환되어 생물학적 반복 실험 전반에 걸쳐 재현 가능한 데이터를 생성할 수 있습니다.
중개 및 전임상 연구
- 질환 관련성: 고형암에서 관찰되는 상승된 세포 외 ATP 미세환경을 반영하여, 인간 종양 제노그라프트 내의 종양 내 ATP 내부화를 모델링합니다.
- 중개적 연속성: in vitro 기전 연구 결과와 in vivo 종양 조직 분석을 연결하여 타겟-파이프라인 정렬을 지원합니다.
- 리스크 조정 기반 진행: 테스트 화합물이 생리학적으로 유의미한 종양 환경에서 ATP 흡수를 조절하는지 밝힘으로써 go/no-go 결정에 정보를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 방법은 발견 생물학 단계에 해당하며, 특히 거대음세포작용(macropinocytosis) 및 퓨린성 신호 전달과 관련된 표적을 중심으로 암 대사의 영양분 획득 메커니즘 및 경로 규명에 관한 가설 검증을 지원합니다.
- 발견 생물학: 종양 세포에서의 대사 재프로그래밍 및 거대음세포작용(macropinocytosis) 활성의 대리 지표로서 ATP 내부화의 기전적 분석을 용이하게 합니다.
- 스크리닝: 처리 조건에 따른 ATP 내부화를 비교하기 위한 정량적 이미징 데이터를 생성하여, 분석법의 표준화 및 히트(hit) 확인을 가능하게 합니다.
- 분석: 내부화 효율을 정량화하고 유전적 또는 약리학적 섭동을 비교할 수 있는 공국소화(colocalization) 및 객체 수 측정 지표를 제공합니다.
- 중개 연구: 세포주에서 얻은 발견을 이종 이식 종양으로 확장하여, 온전한 조직 내 표적 조절의 전임상 검증을 지원합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 암 모델 및 대사 질환 시스템에서 세포 외 영양소 흡수를 연구할 수 있는 재사용 가능한 이미징 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 종양의 공격성과 관련된 핵심 영양소 내부화 경로를 직접 시각화함으로써 표적 검증의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 재현 가능한 시료 준비, 이미징 및 분석 워크플로우를 통해 ATP 내부화 평가를 표준화합니다.
- 전략적 가치: 암세포의 대사 적응을 표적으로 하는 화합물을 조기에 평가할 수 있게 하여 후기 단계의 생물학적 리스크를 줄입니다.
- 포트폴리오 영향: 세포 외 ATP 스캐빈징 및 거대음세포작용 플럭스에 관여하는 표적들의 리스크 조정 우선순위 결정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 형광 현미경, 종양 이종이식 처리 및 형광 추적자 준비에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 다중 채널 획득 기능이 있는 공초점 또는 에피형광 이미징 시스템의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 반복 실험 전반에 걸쳐 종양 주입 부피, 배양 시간 및 조직 처리 과정의 표준화가 필요합니다.
- 포화 또는 비특이적 신호를 방지하기 위해 ATP 유사체 농도와 덱스트란 추적자 비율의 최적화가 포함됩니다.
- 종말 조직 수집이 필요하므로 동일한 동물에서의 종단적 추적은 불가능하다는 제한이 있습니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:05
Tumor Cell Culture and Xenograft Tumor Development
2:41
HMWFD and NHF-ATP Solution Preparation
3:21
ATP Internalization in Tumor Xenograft
3:53
Cryo-embedding
4:45
Tissue Slide Fixation
5:25
Fluorescence Microscopy and Image Acquisition
7:12
Results: Assessment of Nonhydrolyzable Fluorescent ATP Internalization
7:44
Conclusion
