Pyrosequencing : 정확한 Genotyping을위한 간단한 방법

유전학 연구는 인간 게놈 서열의 공개로 인해 큰 혜택을 입었습니다. 파이로 시퀀싱(Pyro sequencing)은 유전적 변이뿐만 아니라 RNA 대립유전자 불균형, DNA 메틸화 상태 및 유전자 복제수를 분석할 수 있는 독특한 시스템입니다. 본 영상에서는 유전 분석을 위한 기본적인 파이로 시퀀싱 반응을 시연합니다.

안녕하세요, 저는 워싱턴 대학교 의과대학 내과 학교의 Charles Eby 박사와 Brian Gage 박사 연구실의 Kristy King입니다. 오늘은 파이로 시퀀싱(pyro sequencing) 절차를 보여드리겠습니다. 이 절차는 SNP를 분석하는 데 사용되는 가장 철저하면서도 간단한 방법 중 하나이기 때문에 매우 유용합니다.

파이로 시퀀싱(Pyro sequencing)은 합성 기반 시퀀싱으로, 개방된 3' DNA 가닥에 뉴클레오타이드가 결합할 때마다 피로인산이 방출되는 원리를 이용합니다. 플레이트 로딩이 완료되면, 소프트웨어에서 제공하는 서열에 따라 뉴클레오타이드가 결합합니다. 방출된 피로인산은 TP의 방출을 유도하는 반응에 사용되며, 루시페레이스(luciferase)는 이 TP를 이용하여 루시페린(Luciferin)을 옥시루시페린(oxyLuciferin)으로 전환시켜 빛을 방출하게 합니다. 검출된 빛은 CCD 카메라로 수집되며, 파이로(pyros)라고도 불리는 피크(peak) 형태로 기록됩니다.

DNA 가닥에 결합되지 않은 모든 뉴클레오타이드는 배경 소음을 방지하기 위해 AP pyra에 의해 분해됩니다. 이 절차는 다음과 같은 단계로 구성됩니다. 분석 설계, 품질 관리를 위한 PCR 젤 전기영동 및 파이로 시퀀싱(pyro sequencing).

그럼 파이로 시퀀싱을 시작해 보겠습니다. 파이로 시퀀싱을 수행하기 위해서는 먼저 PCR 산물을 준비해야 합니다. 파이로 시퀀싱을 위한 PCR은 모든 프라이머가 소진되도록 하기 위해 일반적인 PCR보다 더 많은 사이클(약 50 사이클)이 필요합니다.

파이로 시퀀싱(Pyro sequencing)을 위해서는 PCR 프라이머 중 하나가 비오틴화 되어 있어야 합니다. 마지막으로, 내부 프라이머(internal primer) 또한 필요하다는 점에 유의해야 합니다. 오염이 발생하지 않도록 파이로 시퀀싱을 통해 제공되는 소프트웨어를 사용하여 효율적인 어세이 설계를 수행할 수 있습니다.

PCR 산물이 존재하는지 확인하기 위해 몇 개의 샘플과 음성 대조군에 대해 젤 전기영동을 수행해야 합니다. 파이로 시퀀싱 플레이트를 제작하려면 96웰 파이로 시퀀싱 플레이트에 파이로 시퀀싱 프라이머 믹스 12 µL를 첨가하십시오. 여기에는 내부 프라이머 43.2 µL와 니어링 버퍼 1396.8 µL의 혼합물이 필요하며, 이후 파이로 시퀀싱 플레이트를 접착 필름으로 덮으십시오.

준비 과정이 50분 이상 소요될 경우, 96-well PCR 플레이트의 각 웰에 streptavidin 코팅 sero beads 240 µL, tris-sodium chloride, EDTA 및 tween 20으로 구성된 binding buffer 560 µL, 그리고 물 3,600 µL가 포함된 SRO speed mix 70 µL를 첨가하고 뚜껑을 단단히 닫습니다. 비드 믹스가 들어있는 96-well PCR 플레이트를 플레이트 쉐이커에 넣고 상온에서 5분 동안 흔들어 줍니다.

웰 간의 교차 오염을 방지하기 위해 덮개가 잘 닫혔는지 확인하십시오. 이 단계는 strep ENC가 코팅된 spheros 비즈를 PCR 프라이머에 위치한 biotin 태그에 철저히 결합시키는 과정입니다. 플레이트 준비를 위한 워크스테이션을 설정하십시오.

여기에는 시약 트러프, PCR 생성물 및 비드 혼합 트레이, 그리고 파이로 시퀀싱 프라이머 트레이가 포함됩니다. PCR 생성물 및 비드 혼합 플레이트와 파이로 시퀀싱 프라이머 트레이가 적절하게 정렬되어 음성 대조군들이 동일한 방향으로 놓여 있는지 확인하십시오. 샘플을 옮기기 전, 전원이 꺼진 상태의 진공 툴을 깨끗한 물에 흔들어 툴에 묻어 있을 수 있는 비드나 이물질을 제거하십시오.

남은 물을 버리고 트러프를 다시 채운 후 진공 장치를 켭니다. 모든 물이 제거될 때까지 진공 툴을 트러프에 둡니다(약 30초 소요). 진공 툴의 필터 팁을 PCR 비드 믹스 플레이트의 웰에 넣고 플레이트에서 모든 액체가 제거될 때까지 그대로 둡니다.

표면 장력을 방지하기 위해 가볍게 흔들어 줄 수 있습니다. 액체가 튜브를 통해 흐르기 시작하면 진공 장치를 70% ethanol 트러프에 배치하십시오. 필터 팁이 ethanol을 5초 동안 흡입하도록 둡니다.

0.2 molar 수산화나트륨을 사용하여 DNA를 단일 가닥 PCR 상태로 변성시키고, 세척 버퍼를 사용하여 반복합니다. 이는 PCR 생성물을 정제하고 중화하기 위함입니다. 진공 도구에서 진공 호스를 분리한 후, 어닐링 버퍼 혼합액 내의 파이로 시퀀싱 프라이머가 포함된 파이로 시퀀싱 플레이트에 진공 도구를 배치합니다.

진공 호스가 여전히 연결되어 있는 상태에서 파이로 시퀀싱 플레이트에 넣으면, 프라이머 믹스가 흡입되어 PCR 산물을 손실할 수 있습니다. 파이로 시퀀싱 플레이트의 웰 내에서 진공 팁을 가볍게 흔들거나 쳐서 PCR 산물을 분산시키십시오.

흔들기 또는 록킹 과정이 완료되면 파이로 시퀀싱 플레이트에서 진공 툴을 제거하고, 진공 툴을 호스에 다시 연결한 뒤 깨끗한 물에 넣어 다음 플레이트 사용을 위해 세척합니다. 파이로 시퀀싱 플레이트를 80 °C의 히팅 블록에 2분 동안 둡니다. 2분 후, 플레이트를 히팅 블록에서 꺼내 시원한 표면에 놓습니다.

냉각 후, 15분 이내에 플레이트를 가동하여 증발을 방지하지 않는 한 접착 필름을 사용하여 플레이트를 덮을 수 있습니다. 이제 파이로 시퀀싱(pyro sequencing)을 시작할 차례입니다. 파이로 시퀀싱의 첫 번째 단계는 컴퓨터에 분석 세부 사항을 입력하는 것입니다.

simplex 항목에서 새 항목을 선택하고, ID 이름과 분석할 서열을 포함한 분석 정보를 입력하십시오. 해당 서열은 분석 설계 소프트웨어에서 제공하며 품질 관리를 가능하게 합니다. 분주 순서를 선택하면 SNP 주변의 서열과 컨트롤 염기가 제공됩니다. 마지막으로 히스토그램을 선택하여 피크그램(pygram)의 예상 형태를 시각적으로 확인하십시오. 이제 snip 런을 입력할 차례입니다.

snip runs 및 일반 탭에서 런 이름을 입력하고 해당 런에 대한 기기 파라미터를 선택하십시오. 설정 탭에서 분석 항목을 선택한 다음 플레이트 위로 클릭 및 드래그하십시오. 플레이트에 원하는 분석 항목을 입력할 때, 플레이트 전체를 사용할 필요는 없으며 분석 대상에서 제외할 웰을 비활성화할 수 있다는 점과 하나의 플레이트에서 여러 가지 서로 다른 분석을 수행할 수 있다는 점에 유의하십시오.

보기(view) 탭을 클릭한 다음 실행(Run)을 선택하십시오. 이 페이지에는 실행에 필요한 뉴클레오타이드, 효소 및 기질의 적절한 부피가 나열되어 있습니다. 사용 전 뉴클레오타이드 또는 모세관 팁과 시약 팁을 모두 세척하십시오.

팁에 물을 채우고 팁 상단에 압력을 가하여 팁이 막혔는지 확인합니다. 팁 하단에서 물이 분사되지 않으면, 물을 비우고 다시 채우는 과정을 여러 번 반복하여 물이 강제로 통과하도록 합니다. 또는 팁이 계속 막혀 있는 경우 팁을 초음파 처리할 수 있습니다.

팁을 버리고 새 팁을 사용하십시오. 효소와 기질은 사용 전에 물로 재현탁해야 합니다. 흔들 경우 기포가 발생하여 팁이 막히거나 분주가 일정하지 않을 수 있으므로, 사용하지 않은 재현탁 효소와 기질은 -20°C에서 보관할 수 있습니다.

마이크로 원심분리 튜브 내의 모세관 분주 팁을 추후에 사용하기 위해, 뉴클레오타이드와 TE buffer P8을 1:1로 희석합니다. 사용 전 충분히 혼합하십시오. 소프트웨어에서 제안한 양에 따라 적절한 부피의 뉴클레오타이드와 시약을 팁에 채웁니다.

팁 내부로 공기 방울이 유입되어 폐쇄가 발생하는 것을 방지하기 위해, 액체를 팁 벽면을 따라 천천히 분주하십시오. 뉴클레오타이드 분주 팁에 공기 방울이 있는지 반드시 확인하십시오. 공기 방울이 있을 경우, 공기 방울이 표면으로 올라올 때까지 팁 옆면을 가볍게 두드리거나 깨끗한 피펫 팁을 사용하여 제거하십시오.

카트리지를 채운 후 테스트 플레이트를 실행하십시오. 파이로 시퀀싱 기기에 카트리지를 장착하고 96웰 플레이트 플랫폼에 테스트 플레이트를 배치하십시오. 플레이트 위에 접착 필름을 덮으면 시약과 뉴클레오타이드의 분주 상태를 쉽게 확인할 수 있습니다.

화면 왼쪽의 기기 탭을 선택한 다음, 관리(manage)를 클릭하십시오. 드롭다운 메뉴에서 해당 기기를 선택하십시오. 테스트(test)를 클릭하면 경고 메시지가 나타납니다.

테스트 플레이트가 기기에 장착되었는지 확인하십시오. 확인 버튼을 클릭합니다. 완료되면 테스트 플레이트를 꺼내십시오. 플레이트 중앙의 6개 웰 위에 4가지 뉴클레오타이드, 효소 및 기질을 나타내는 액체 방울이 형성되어 있어야 합니다.

작은 점이 6개 미만인 경우 막힘이 발생한 것이므로, 팁을 점검하여 막힌 부분을 제거해야 합니다. 플레이트를 pyro sequencing 96-well 플레이트 플랫폼에 놓습니다. 모든 레버를 닫고 개별 플레이트의 run을 클릭합니다.

효소 기질과 뉴클레오타이드를 설정하여 미리 정해진 순서대로 분주하도록 실행합니다. 파이로시퀀서(pyro sequencer)에 의해 분석이 완료되면, 실행 결과를 검토할 차례입니다. 파란색 웰은 유전자형과 파이로 시퀀싱 결과가 통과되었음을 나타냅니다.

주황색 웰은 수동 개입이 필요하며, 해당 웰을 클릭하고 예측 히스토그램을 열어 편집할 수 있습니다. 유전형에 대해 합격, 불합격 또는 확인 판정을 내릴 수 있으며, 유전형 자체를 적절하게 변경할 수도 있습니다. 웰을 편집하면 플레이트 맵에 어두운 원이 표시됩니다.

음성 대조군은 음성으로 판독해야 합니다. 음성 웰에서 비특이적 피크가 나타날 수 있으나, 이는 일반적으로 내부 프라이머의 루핑으로 인해 발생합니다. 지금까지 인간 게놈의 다형성을 파이 시퀀싱(py sequence)하는 방법을 살펴보았습니다.

DNA 파이로 시퀀싱(Pyro sequencing)은 광범위한 응용 분야에 적용 가능하다는 점에서 다른 시퀀싱 절차보다 유용합니다. 또한 저농도 및 분해된 DNA를 포함하여 모든 소스의 DNA를 처리할 수 있을 만큼 견고합니다. 이 절차를 수행할 때는 깨끗하고 품질이 좋은 PCR 산물로 시작하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.

각 분석에 음성 대조군을 포함하고 모든 시약의 상태가 양호한지 확인하십시오. 이것으로 모든 설명을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.