진핵 글리코겐 대사 연구를위한 분광 광도법

이 프로토콜은 방사성 동위 원소의 사용을 피하고 많은 근로자가 글리코겐 대사 효소를 연구하는 것을 방해 할 수있는 장벽을 제거하기 때문에 중요합니다. 설명 된 절차는 저렴하며 간단한 분광 광도계에만 액세스하면됩니다. 글리코겐 합성 효소 활성의 측정으로 시작하려면 이전에 준비된 UDP 포도당, ATP, 포스 포에 놀 피루 베이트 및 NDP 키나아제의 저장 용액을 얼음에서 해동하십시오.

수조를 섭씨 30도까지 예열하십시오. 스톡 용액이 준비되면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 시약을 15밀리리터 튜브에 추가하여 글리코겐 합성효소 분석 수에 따라 충분한 분석 혼합물을 준비합니다. 반응 혼합물로부터의 NADH를 물로 대체하여 블랭크 반응을 준비하고, 반응물을 일회용 메타크릴레이트 큐벳으로 옮긴다.

블랭크 반응을 사용하여 340 나노 미터의 파장에서 분광 광도계에 0을 설정하십시오. 반응 혼합물의 770 마이크로리터 분취량을 1.5 밀리리터 튜브에 취하고, NDP 키나아제 및 피루베이트 키나아제 혼합물을 각각 2 마이크로리터 튜브에 순차적으로 첨가한다. 혼합 후, 반응 혼합물을 예열하기 위해 수조에서 섭씨 30도에서 3 분 동안 튜브를 부드럽게 배양한다.

이어서, 글리코겐 합성효소를 함유하는 샘플 30 마이크로리터를 pH 7.8에서 20 밀리몰 트리스 완충액에 첨가하고, 반응 혼합물을 폐기 메타크릴레이트 큐벳으로 옮기기 전에 부드럽게 혼합한다. 큐벳을 분광 광도계에 넣고 340 나노 미터에서 10-20 분 동안 시간 간격으로 흡광도를 기록합니다. 그런 다음 시간에 대해 얻은 흡광도를 플로팅합니다.

방출된 포도당을 측정하려면 가열된 글리코겐 샘플에서 40마이크로리터의 상청액을 일회용 메타크릴레이트 큐벳으로 옮깁니다. 측정된 부피의 트리에탄올아민, 염산마그네슘 설페이트 완충액, NADP ATP 혼합물 및 물을 원고에 기재된 바와 같이 첨가한다. 기포를 만들지 않고 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 혼합물을 혼합합니다.

0.5 마이크로 리터의 포도당 -6- 인산 탈수소 효소를 각 큐벳에 첨가하십시오. 피펫팅으로 혼합한 후, 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양한 다음, 340 나노미터에서 흡광도를 기록한다. 다음으로, 앞서 설명한 바와 같이 각 큐벳에 0.5 마이크로리터의 헥소키나아제를 혼합하고, 흡수제 세트를 340 나노미터로 기록하기 전에 15분 동안 배양한다.

이어서 실온에서 5분 동안 인큐베이션을 계속하고, 흡광도를 기록하였다. 흡수가 15분에 기록된 것보다 증가한 경우, 340 나노미터에서 최종 흡수를 기록하기 전에 5분 동안 계속 배양한다. 글리코겐 분지를 측정하려면 650 마이크로 리터의 요오드 염화칼슘 컬러 시약 스톡을 1.5 밀리리터 튜브의 물 100 마이크로 리터와 결합하고 일회용 메타 크릴 레이트 큐벳으로 옮기기 전에 용액을 완전히 혼합하십시오.

큐벳을 분광 광도계에 놓고 330에서 800 나노 미터까지 배경 스펙트럼을 수집하기위한 파장 스캐닝 모드에서 실행을 수행합니다. 별도의 1.5 밀리리터 튜브에서 650 마이크로 리터의 작동 요오드 염화칼슘 색 시약과 50 마이크로 그램의 굴 글리코겐을 결합하고 물로 최종 부피를 750 마이크로 리터로 구성합니다. 혼합물을 완전히 블렌딩 한 후 용액을 일회용 메타 크릴 레이트 큐벳으로 옮겨 330에서 800 나노 미터의 흡수 스펙트럼을 수집합니다.

유사하게, 앞서 설명한 바와 같이 50 마이크로그램의 아밀로펙틴과 30 마이크로그램의 아밀로오스를 갖는 흡수 스펙트럼을 얻는다. 특성화되지 않은 글리코겐 샘플의 분지 구조에 대한 표시를 얻으려면 25-50 마이크로 그램의 글리코겐을 650 마이크로 리터의 작동 요오드 염화칼슘 색 시약과 결합하고 앞에서 설명한대로 진행하여 흡수 스펙트럼을 획득하십시오. 글리코겐 합성 효소 분석에서, 시간 경과에 따른 340 나노미터에서의 흡수의 선형 감소가 관찰되었다.

분석에 너무 많은 글리코겐 합성 효소를 첨가하면 반응이 처음 2 분 이내에 완료되었습니다. 글리코겐 합성 효소를 포함하지 않은 대조 반응은 흡광도의 측정 가능한 감소를 보이지 않습니다. 정제된 효소를 사용한 글리코겐 인산화 효소 분석으로부터의 데이터는 3분 동안 지속되는 선형 단계를 가졌다.

분당 약 0.01에서 0.04 단위의 흡광도 증가 속도가 최적입니다. 글리코겐 탈분지화 효소 분석에서, 반응은 적어도 10분 동안 지속되는 선형 상을 나타내었다. 글리코겐 분지 효소 분석법의 대표 데이터는 분지 효소가 부족한 대조군 샘플과 분지 효소가 포함 된 반응 간의 흡광도 차이를 보여주었습니다.

분석의 좁은 동적 범위가 예시되어 있다. 생성 할 수있는 흡광도의 최대 변화는 0.4 흡광도 단위이며, 흡수의 변화가 약 0.2 흡광도 단위이면 선형성이 손실됩니다. 글리코겐 분지 평가에 사용된 글리코겐, 아밀로펙틴 및 아밀로오스의 질량은 각각 다른 흡광도 최대값에서 약 0.7 내지 0.8의 최대 흡광도 판독값을 나타냈다.

글리코겐 샘플은 약 400 나노 미터와 460 나노 미터에서 두 개의 피크를 생성했습니다. 요오드 염화칼슘 색 시약은 매우 조밀합니다. 흡수 스펙트럼을 수집하기 전에 글리코겐 샘플이 시약과 완전히 혼합되었는지 확인하는 것이 중요합니다.