다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
2024년 8월 9일
여기에서는 후속 다중 파라미터 라이브 셀 현미경을 수행하기 위한 다양한 다세포 스페로이드 형성 방법을 설명합니다. 형광 평생 이미징 현미경(FLIM), 세포 자가형광, 염색 염료 및 나노 입자를 사용하여 살아있는 3차원(3D) 암 및 줄기 세포 유래 스페로이드에서 세포 대사, 저산소증 및 세포 사멸을 분석하는 접근 방식을 시연합니다.
본 연구에서는 생세포 현미경을 이용하여 세포 대사 및 산소 분포를 분석할 수 있는 스페로이드 형성 방법을 제시하고 비교합니다. 최근 몇 년 동안 형광 수명 이미징 현미경은 살아있는 세포에서 NADPH 및 FAD와 같은 대사 바이오마커를 조사하는 데 광범위하게 사용되었으며, 세포 및 조직 산소화의 이미징과 함께 이러한 측정을 다중화하기 위해 여러 형광 나노입자가 개발되었습니다. 다세포 스페로이드, 오가노이드 및 장기 칩(organ-on-a-chip)은 복잡한 생체 내 미세환경을 복제할 수 있어 동물 연구의 필요성을 최소화할 수 있습니다.
스페로이드 생산을 위해 우리는 다양한 형성 방법을 보여주며 낮은 처리량에서 높은 처리량에 이르기까지 다양할 수 있습니다. 또한 광학 접근성, 형광 수명 이미징 현미경과의 호환성, 세포외 기질 구성 요소를 포함할 수 있는 가능성을 강조합니다. 따라서 3D in vitro 모델이 2D 배양에 비해 더 나은 컨텍스트를 제공하더라도 높은 변동성, 낮은 재현성 및 불완전한 실험 보고가 여전히 문제로 남아 있습니다.
스페로이드 크기, 영양소 조성, 세포외 점도, 심지어 스페로이드 형성 방법과 같은 매개변수는 모두 세포 이질성을 증가시킬 수 있습니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 스페로이드 생산 방법을 조화시키고 표준화하는 것을 목표로 하며, FLIM 현미경을 사용하여 스페로이드의 연속 및 다중 파라미터 분석에 중요한 핵심 측면을 강조합니다.
개요
본 논문은 살아있는 세포 현미경 분석을 통해 세포 대사와 산소 분포를 분석하기 위한 다세포 스페로이드 형성의 다양한 방법을 제시합니다. 본 연구에서는 살아있는 세포 내 대사 바이오마커를 조사하기 위한 형광 수명 이미징 현미경(FLIM)의 활용을 강조합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포생물학
- 살아있는 세포 이미징
배경
- 다세포 스페로이드와 오가노이드는 생체 내와 유사한 미세환경을 재현합니다.
- 형광 수명 이미징 현미경은 대사 바이오마커를 연구하는 데 사용됩니다.
- 높은 변동성과 낮은 재현성은 3D in vitro 모델의 주요 과제입니다.
- 다양한 응용 분야에 따라 서로 다른 스페로이드 형성 방법을 채택할 수 있습니다.
연구 목적
- 생세포 현미경 관찰을 위한 스페로이드 형성 방법들을 비교합니다.
- 3D 모델에서 세포 대사, 저산소증 및 세포 사멸을 분석합니다.
- 다세포 시스템 내 산소 분포에 대한 이해를 높입니다.
사용된 방법
- 형광 수명 이미징 현미경법 (FLIM)
- 세포 자가형광 분석
- 염색 시약 및 형광 나노입자의 활용
- 다양한 스페로이드 형성 기술
주요 결과
- 3D 스페로이드의 세포 대사를 분석하는 방법들을 입증하였습니다.
- 대사 연구를 위해 스페로이드와 FLIM의 호환성을 보여주었습니다.
- 스페로이드 형성에 있어 세포외 기질 성분의 중요성을 강조하였습니다.
- 3D 배양의 재현성 및 변동성과 관련된 문제점들을 다루었습니다.
결론
- 다양한 스페로이드 형성 방법은 살아있는 세포 분석을 향상시킬 수 있습니다.
- FLIM은 3D 모델의 대사 과정에 대한 유용한 통찰력을 제공합니다.
- 이러한 방법의 지속적인 개발은 동물 모델에 대한 의존도를 낮출 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
다세포 스페로이드의 표준화된 제작 및 다중 파라미터 FLIM 분석은 신약 개발을 위한 종양 미세환경 모델링의 핵심 과제들을 해결합니다. 스페로이드 형성 및 살아있는 세포 이미징 워크플로우를 조화롭게 통합함으로써 대사 및 저산소증 관련 판독 값의 예측 신뢰도를 높여, 초기 단계의 견고한 의사결정을 지원합니다. 이러한 접근 방식은 종양학 및 줄기세포 R&D 포트폴리오 전반에 걸쳐 중개 연구의 연속성을 강화하고 생물학적 리스크를 줄여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 생리학적으로 유의미한 3D 모델에서 대사 경로와 산소 구배의 분석을 가능하게 합니다.
- 살아있는 스페로이드 내의 NADPH 및 FAD 바이오마커를 정량화하여 기능적 타겟 검증을 지원합니다.
- 다중 대사 및 저산소 측정(multiplexed metabolic and hypoxia measurements)을 통해 생물학적 리스크 감소를 촉진합니다.
- 복잡한 시스템 내 타겟 결합 및 경로 조절에 대한 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 와이드필드, 공초점 및 이광자 FLIM 플랫폼과 호환되는 재현 가능한 3D 스페로이드 모델을 제작합니다.
- 에세이 조건을 표준화하여 변동성을 줄이고 정량적 결과의 신뢰성을 높입니다.
- 화합물이 세포 대사 및 생존력에 미치는 영향에 대해 확장 가능한 고처리량 스크리닝을 가능하게 합니다.
- 다중 판독을 위한 바이오 및 나노센서 통합의 강력한 평가를 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질환 관련 종양 미세환경과 in vitro 대사 및 저산소 프로파일을 일치시킵니다.
- 동물 모델 의존도를 최소화하여 발견 단계부터 전임상 검증까지의 연속성을 제공합니다.
- 정량적, 다매개변수 데이터를 기반으로 위험 조정된 진행 결정을 가능하게 합니다.
- 라이브 셀 FLIM 출력물을 사용하여 중개 바이오마커 개발을 촉진합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 조화된 워크플로우는 표준화된 스페로이드 제작과 FLIM 분석을 활용하여, 초기 발굴부터 리드 화합물 식별 및 전임상 검증까지의 과정을 통합합니다.
- 발견 생물학: 3D 및 in vivo 유사 환경에서의 가설 검증과 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 화합물 선별을 위해 재현 가능하고 정량적인 대사 및 저산소 상태 판독 값을 제공합니다.
- 분석: 견고한 조건 비교를 위해 다중 형광 수명 측정을 제공합니다.
- 중개 연구: 종양 미세환경 특징을 재현함으로써 in vitro 연구 결과와 전임상 모델 간의 가교 역할을 합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 종양학 및 줄기세포 R&D 프로그램을 위한 재사용 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 3D 모델 시스템에서 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 살아있는 세포 이미징 워크플로의 표준화, 재현성 및 확장성을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 견고한 정량적 데이터를 제공함으로써 go/no-go 결정 및 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 생물학적 관련성이 검증된 후보 물질의 위험 조정 우선순위 지정 및 진전을 가능하게 합니다.
구현 고려 사항
- 3D 세포 배양, 살아있는 세포 현미경 관찰 및 FLIM 분석에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 와이드필드, 공초점 또는 이광자 FLIM 장비와 호환 가능한 분석 소프트웨어의 사용 권한이 필요합니다.
- 스페로이드 제작 및 이미징 프로토콜에 대한 팀 간의 표준화가 필수적입니다.
- 세포 유형, 세포외 기질 또는 센서 통합 방식에 따라 조정이 필요할 수 있습니다.
- 스페로이드의 크기와 구성의 가변성이 재현성과 데이터 해석에 영향을 미칠 수 있습니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
