Minibioreactor Array(MBRA)의 조립 및 사용을 위한 업데이트된 프로토콜

따라서 우리의 연구는 장내 미생물군집, 특히 유해한 병원체의 집락화를 방지하기 위해 장내 미생물군집을 설계할 수 있는 방법에 중점을 둡니다. 동시에 우리는 이러한 식민지 저항 뒤에 숨은 생태학적 규칙과 메커니즘을 이해하는 데에도 관심이 있습니다. 차세대 시퀀싱, 첨단 생물정보학, 무균 마우스, 체외 장 모델과 같은 기술은 모두 우리가 미생물 군집과 건강 및 질병에서 미생물의 역할을 연구하는 방식을 변화시키고 있습니다.

체외 장 모델의 가장 큰 과제 중 하나는 높은 처리량으로 작동하는 것입니다. 우리에게 필요한 것은 미생물 군집을 대규모로 기능적으로 조사할 수 있는 시스템입니다. 미니바이오리액터 어레이는 다른 시스템의 처리 용량 부족을 해결하도록 설계된 연속 흐름 배양 시스템입니다.

이를 통해 복잡하고 재현 가능한 미생물 군집 행동을 포착하면서 실험을 확장할 수 있습니다. 시작하려면 미니바이오리액터 어레이 스트립이 3D 프린팅되고 6개의 독립적인 바이오리액터 챔버가 포함되어 있는지 확인하십시오. 조립에 필요한 모든 구성 요소를 정렬합니다.

T-핸들 탭 렌치와 함께 1/4인치 28NF 분수 탭을 사용합니다. 각 챔버에 3개의 1/4인치 포트를 끼워 피팅을 삽입합니다. 챔버를 물로 세척한 후 각 챔버에 10 x 3mm 자기 교반 막대를 넣고 증류수 1ml를 추가합니다.

그런 다음 바이오리액터의 각 포트 위에 고무 와셔를 배치합니다. 각 챔버에 대해 하나의 미디어 빨대 나사산 수 미끼, 하나의 폐 빨대 나사산 수 미끼 및 하나의 빈 나사산 수 미끼를 포트에 나사로 고정합니다. 이제 6개의 고무 격막을 3/32인치 암컷 미끼 미늘에 삽입하고 각 격막의 위쪽 소매를 아래로 접어 목을 덮습니다.

이를 각 챔버의 지정된 포트에 부착합니다. 원하는 길이와 수의 C-flex 튜빙 스트립을 절단합니다. 1/8인치 암 미끼 미늘을 한쪽 끝에 부착하고 각 길이의 튜브의 반대쪽 끝에 수 미끼 잠금 커넥터를 부착합니다.

그런 다음 내경이 1.14mm인 빨간색 2스톱 E-lab 튜브와 내경이 0.89mm인 주황색 2스톱 E-lab 튜브의 양쪽 끝에 1/16인치 암컷 미끼 미늘을 삽입합니다. 준비된 E-lab 튜브를 C-flex 튜브에 연결하고 6개의 C-flex 튜브 길이가 암 미끼를 통해 빨간색 및 주황색 E-lab 라인 1개에 연결되었는지 확인합니다. 그런 다음 필요에 따라 C-flex 튜브를 다른 길이로 자릅니다.

1/8인치 암 미끼 미늘과 수 미끼 잠금 커넥터를 3인치 조각 1개와 12인치 C-flex 튜브 조각의 양쪽 끝에 부착합니다. 나머지 조각의 양쪽 끝에 수 미끼 잠금 커넥터를 부착합니다. 3D 다이어그램에 따라 폐기물 라인 트리를 조립합니다.

빨간색 2스톱 E-lab 튜브의 노출된 끝을 C-flex 튜브 길이를 기준으로 오름차순으로 폐기물 라인 트리의 터미널 수 미끼 잠금 장치에 부착합니다. 그런 다음 3/1인치 암 미끼 미늘 및 8인치 암 미끼 잠금 커넥터가 있는 8인치 C-flex 튜브를 폐기물 라인 트리 상단에 연결합니다. 3D 다이어그램에 따라 피드 라인 트리를 조립합니다.

주황색 2스톱 E-lab 튜브의 노출된 끝을 C-flex 튜브 길이를 기준으로 오름차순으로 피드 라인 트리의 터미널 수 미끼 잠금 장치에 연결하고 12인치 C-flex 튜브를 피드 라인 트리의 상단에 부착합니다. 공급 라인 트리 끝에 있는 가변 길이 C-flex 튜브를 바이오리액터에 부착하고 왼쪽의 가장 짧은 선에서 오른쪽의 가장 긴 선까지 오름차순으로 배열합니다. 폐기물 라인 트리 끝에 있는 가변 길이의 C-flex 튜브를 바이오리액터 스트립에 내림차순으로 부착하여 가장 긴 선은 왼쪽에, 가장 짧은 선은 오른쪽에 배치하여 펌프 배치를 수용합니다.

모든 C-flex 피드 라인을 스트립의 왼쪽에 함께 묶고 트위스트 타이로 고정합니다. C-flex 라인 사이에 주황색 2스톱 E-lab 튜브로 루프를 형성하고 오토클레이브 테이프를 사용하여 루프를 고정한 다음 바이오리액터 스트립의 폐기물 쪽에 빨간색 2스톱 E-lab 튜브에 대해 이 과정을 반복합니다. 폐기물 끝에 있는 암컷 미끼를 덮고 오염을 방지하기 위해 라인 나무에 호일로 먹이를 줍니다.

각 바이오리액터 챔버의 격막이 있는 수나사 미끼를 풀어 오토클레이브 중에 증기가 빠져나갈 수 있도록 합니다. 어셈블리를 오토클레이브 빈에 넣은 후 사료 및 폐기물 라인 나무를 MBRA 스트립이 들어 있는 빈에 인접한 별도의 빈으로 늘립니다. 시스템을 펌프에 부착하려면 폐기물 및 공급 라인 모두에 대해 E-lab 튜브를 고정하는 오토클레이브 테이프를 제거하고 C-flex 튜브 묶음을 풉니다.

교반판 상단의 두 펌프 사이에 MBRA를 배치합니다. 3D 프린팅 홀더를 사용하여 고정하고 플레이트에 표시된 교반 위치에 맞춥니다. 이제 공급 라인 E-lab 튜브를 연동 펌프 카트리지에 부착하고 튜브 스톱을 카트리지 슬롯에 배치합니다.

교반판 오른쪽에 있는 펌프의 폐기물 라인 E-lab 튜브에 대해 이 과정을 반복합니다. 그런 다음 연동 펌프 카트리지를 펌프에 잠급니다. 3D 프린팅 튜브 홀더를 사용하여 C-flex 튜브를 깔끔하게 배열합니다.

폐기물 라인 트리의 끝을 폐기물병에 연결된 튜브에 연결합니다. 그런 다음 피드 라인 입구 튜브의 암 미끼를 미디어 병 뚜껑의 12인치 튜브의 수 커넥터에 부착합니다. 두 펌프를 모두 켜서 매체 흐름을 시작하고 폐기물이 펌프 오른쪽에 위치할 때 두 펌프가 시계 방향으로 회전하도록 설정되어 있는지 확인합니다.

각 바이오리액터 챔버의 액적 크기와 케이던스를 관찰합니다. 변동성이나 이상이 발견되면 영향을 받는 챔버에 연결된 주황색 2스톱 E-lab 튜브를 교체하여 유량 변동을 줄이십시오. 챔버가 가득 차면 두 펌프를 모두 끄고 실험을 시작하기 전에 생물 반응기를 24-48시간 동안 방치하여 오염 여부를 확인합니다.

매체 입력을 탈이온수에 담긴 10% 표백제가 담긴 1리터 용기로 전환하고 두 펌프의 유량을 최대로 높여 바이오리액터 챔버의 내용물을 표백제로 대체합니다. 챔버에 매체가 제거되면 MBRA를 뒤집어 충전 라인 위에서 5분 동안 소독합니다. 5분 후 시스템을 바로 전환하고 멸균을 위해 5분 더 기다립니다.

챔버에서 매체를 제거하고 10분 동안 멸균한 후 표백제를 1리터의 탈이온수로 교체하고 물이 통과할 때까지 시스템을 세척합니다. 그런 다음 펌프에서 바이오리액터 E-lab 튜브를 분리하고 MBRA를 제거합니다. 생물 반응기에서 사용한 격막을 제거하고 물이 1밀리리터만 남을 때까지 각 챔버를 배출합니다.

격막, 주황색 2스톱 E-lab 튜브를 교체하고 이전에 설명한 대로 완전히 조립된 스트립을 오토클레이브합니다. 세 주기의 재사용 후 다음 단계를 수행합니다. 인간 대변 샘플을 준비하고 MBRA 시스템에서 성장시켰습니다.

4일간의 연속 흐름 후, 9개의 생물반응기 모두의 미생물 군집은 18개의 박테리아 속에 의해 지배되었으며, 각 속은 모든 복제에서 상대적 풍부도의 최소 2%를 구성했습니다. 검출된 65개 속 중 22개가 9개의 생물반응기 복제 모두에 존재하여 높은 재현성을 입증했습니다. 알파 다양성 분석은 관찰된 운영 분류 단위와 Shannon 다양성 지수 모두에서 반복 사이의 최소한의 변동을 보여주었습니다.