Microinjection을 사용 Aphids에 바이러스성 전송 생리 장벽을 테스트

만약 곤충이 식물 바이러스의 효과적인 매개체라면, 그리고 바이러스를 미세 주입하는 경우, 오늘 저희가 보여드릴 절차는 연구자가 바이러스를 AFib의 혈세포(hemo cell)에 직접 주입하여, 순환식 전파의 두 가지 주요 장벽 중 하나인 장을 우회할 수 있게 하는 기술입니다. 안녕하세요, 저는 코넬 대학교 식물 병리학과의 박사후 연구원 세실리아 탐린 데히(Cecilia Tamrin Dehi)입니다. 오늘은 바이러스를 AFib 혈세포에 주입하는 방법을 보여드리겠습니다. 이렇게 주입된 바이러스는 이후 다양한 식물 종으로 전파될 수 있습니다.

예를 들어, 이 FE 식물은 PLRV 감자 잎 말림 바이러스에 감염되었습니다. 건강한 식물과 감염된 식물의 차이를 확인할 수 있습니다. 가장 눈에 띄는 증상은 잎의 경화 현상입니다.

PLRV는 포유류의 혈액에 해당하는 곤충의 혈림프에 의해 운반되는 루티어 바이러스입니다. 감염되지 않은 AFI가 감염된 식물을 섭식하면, 여기에서 볼 수 있는 식물즙을 통해 바이러스에 감염됩니다. 일단 섭취된 바이러스는 곤충의 장에서 혈림프를 거쳐 침샘을 통과해야만 다시 ESE 식물로 전염될 수 있습니다.

ESE 식물을 섭식할 때 많은 바이러스를 획득할 수 있지만, 장과 침샘을 통과하는 분율은 더 적을 수 있습니다. 이는 더 많은 식물을 감염시켜 테스트하기 위한 전송의 두 가지 주요 장벽입니다. 만약 AFI가 바이러스를 매개하지 못한다면, 우리는 진딧물을 감염된 조직에서 2일 동안 섭식하게 한 다음, 건강한 식물에서 5일 동안 섭식하도록 합니다.

그 후 식물에 훈증 처리를 하고 3주 후에 증상을 탐색하기 시작합니다. 바이러스를 매개하지 못하는 AFib을 발견하면, 오늘 보여드릴 미세주입 절차를 통해 두 가지 장벽 중 어느 것이 바이러스를 차단하고 있는지 평가할 수 있습니다. 이 절차에서는 바이러스를 혈구 세포에 직접 주입하여 장 전송 장벽을 우회합니다.

그럼 이제 시작하겠습니다. 이제 apex를 미세 주입하는 방법을 보여드리겠습니다. 이것은 우리가 사용하는 유리 바늘입니다. APU를 사용하여 이 유리 쉴드로부터 유리 바늘을 뽑아냅니다.

이것은 바이러스의 미세 주입을 위한 마이크로 인젝터입니다. 이제 니들 홀더에 바늘을 끼우겠습니다.

이제 바늘을 제자리에 꽂겠습니다. 이제 바이러스를 이 헬름의 상단까지 바늘에 충전하겠습니다. 이제 미세주입을 위해 AFI의 위치를 잡아야 합니다.

이제 압력 패드가 부착된 진딧물을 가져와서 진딧물 홀더에 고정하겠습니다. 진딧물의 복부 부분에 접근할 수 있도록, 진딧물의 등 부분이 홀더에 닿게 배치하는 것이 이상적입니다. 좋습니다.

이제 미세주입을 진행하겠습니다. 바늘의 위치를 잡고 AFib에 가까이 가져가겠습니다. 이제 바늘을 AFib에 접촉시키겠습니다. 외골격을 관통하기 위해서는 다리 기저부의 마디 사이를 찌르는 것이 가장 좋습니다.

이제 주입을 시작하겠습니다. 브러시로 AFI를 취해 회수 용지에 옮긴 후 잠시 회수되도록 두겠습니다. 또한 대조군 AFI도 미세 주입해야 합니다.

이 대조군 미세 주입은 바이러스가 포함되지 않은 완충액만으로 수행합니다. 사용하는 완충액은 0.1 M 인산 완충액 pH 7입니다. 애피드(aphid)를 건강한 식물에 배치하고 5일 동안 섭식하게 한 뒤, 식물을 제거하고 증상 발현을 기다립니다. 하위 가닥 RNA를 미세 주입한 후 일주일 동안 매일 애피드 내 표적 유전자의 발현 수준을 측정합니다.

바이러스를 전파하지 못하는 아피스(afid)에 미세주입을 완료했습니다. 미세주입 후 아피스가 바이러스를 전파할 수 있게 된다면, 이는 해당 아피스가 바이러스를 차단하는 장벽인 장벽(gut barrier)을 가지고 있었음을 의미합니다. 반대로 증상이 나타나지 않는다면, 이 아피스가 강력한 침샘 장벽(salivary gland barrier)을 가지고 있음을 의미합니다.

지금까지 진딧물에 바이러스를 미세 주입하는 방법을 살펴보았습니다. 이와 동일한 절차를 통해 진딧물에 이중 가닥 RNA를 미세 주입하여 RNA 간섭(RNAi)를 수행하며, 이는 진딧물의 유전자 기능을 연구하는 데 유용한 흥미로운 기술입니다. 이것으로 미세 주입 과정에 대한 설명을 마칩니다.

이 영상이 유익하며 여러분의 실험에 도움이 되기를 바랍니다. 감사합니다.