코팅된 필터와 프리필터가 에어로졸화된 Phi6 바이러스의 감염성 및 농도에 미치는 영향 평가

우리는 실내 환경에서 공기 중 바이러스 감염성과 농도를 줄이는 데 있어 프리필터와 항바이러스 코팅이 미치는 영향을 조사합니다. 현재 접근법은 현실적인 공기 흐름 역학을 놓치고 있습니다. 저희 프로토콜은 에어로졸 상태를 재현하고 감염 바이러스와 총 바이러스 부하를 모두 측정합니다.

우선, 정제된 phi6 박테리오파지 현탁액을 pH 7.2에 조정한 1밀몰라 염화마그네슘 완충액 20밀리몰라 인산칼륨 버퍼에 희석합니다. 표면 테스트를 수행하기 위해 생물안전 캐비닛 내 모든 필터, 프리필터, 항바이러스 코팅 재료를 조립하세요. 구리 또는 구리 및 은 활성 성분이 독점 매트릭스에 내장된 모든 코팅 재료(A6, B4, VS, VS B)의 항바이러스 활성을 평평한 시험 조각에 평가합니다.

다음으로, 희석된 phi6 박테리오파지 스톡 용액 20마이크로리터를 코팅된 시험 조각에 피펫 채워 표면 생존 가능성 분석을 수행합니다. 멸균 유리 삼각형을 사용해 샘플을 2x2센티미터 크기에 고르게 펴 놓습니다. 샘플을 22도 섭씨에서 최대 네 개의 시점(1분, 5분, 1시간, 3시간 포함)까지 배큐합니다.

각 시점 후 바이러스를 회수하기 위해 표면에 신선한 LB 육수를 180마이크로리터 추가하세요. 표면을 10번에서 20번 반복 피펫팅하여 샘플을 채취하세요. 플라스틱 페트리 접시를 제어면으로 사용하세요.

감염성 바이러스 입자 수를 측정하는 플라크 분석법과 바이러스 게놈 복제 수를 측정하는 정량적 역전사효소 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)을 이용해 표면 코팅의 항바이러스 효능을 정량화합니다. 정제 및 농축된 phi6 박테리오파지 현탁액을 희석하여 2.5 × 10의 제곱에서 4.08 × 10에서 11제곱 플라크 형성 단위 11의 제곱 단위 범위의 바이러스 농도를 얻습니다. 다음으로, 원통형 유리 본체와 일치하는 뚜껑을 사용하여 실험용 에어로졸 챔버를 조립합니다.

내부 금속 비계를 챔버에 삽입하고 단열 가스켓을 고정하여 기밀 밀봉을 보장합니다. 네뷸라이저와 에어펌프를 함께 사용하여 안정적이고 재현 가능한 바이러스 에어로졸 입력을 생성하세요. 각 실험 전후에 네뷸라이저에 사용된 바이러스 용액을 조절하여 안정성을 모니터링하세요.

챔버 내에서 에어로졸 유량을 분당 8리터로 설정하세요. 장시간 측정 중 습도를 줄이기 위해 약 4분의 3의 에어로졸 흐름을 고효율 입자 공기 필터(HEPA)를 통해 배기구로 전달합니다. 분당 2리터에 해당하는 나머지 4분의 1의 유량이 챔버로 들어오도록 허용합니다.

깔때기를 사용해 에어로졸 흐름을 챔버 내 필터 또는 프리필터 표면 쪽으로 유도하세요. HEPA 필터와 유량계를 과도한 습기로부터 보호하기 위해 건조기를 사용해 배출 공기 흐름을 제습하세요. 외부 펌프를 사용하여 시스템 내에 음압을 생성하고, 배출구를 통한 효율적인 배기를 보장하기 위해 공기 흐름을 더욱 지원합니다.

에어로졸 챔버 내 이중 유리섬유 재료와 함께 코팅되지 않은 또는 VS B-코팅 폴리에스터 및 불프렌 프리필터의 항바이러스 특성을 평가합니다. 팩션 샘플링을 통한 항바이러스 효과를 평가하기 위해, 입자 침착을 극대화하기 위해 pH 7.2의 20밀리몰라 HEPES 버퍼가 들어 있는 페트리 접시를 시험 프리필터 바로 아래에 배치합니다. 또는 GF2 필터의 항바이러스 효과를 시험하기 위해, 외부 펌프에 연결된 삼중 노즐 전글라스 소용돌이 임핑저를 설치해 에어로졸 수집을 할 수 있습니다.

테스트 프리필터나 필터를 통해 분당 2리터의 공기 흐름을 유지하세요. 챔버 출구 뒤에 추가 밸브를 사용해 총 공기 유입량을 분당 10리터로 늘립니다. 에어로졸을 20밀리몰라 HEPES 완충제 5밀리리터에 포집하세요.

그리고 증발한 버퍼는 30분마다 보충하세요. 삼중 샘플링의 경우, 각 실험 전후로 15분간 프리필터나 필터 없이 대조 실험을 수행하세요. 사전 실험 제어 실행 후, 필터 또는 사전 필터를 챔버에 삽입하고 시스템을 3시간 동안 작동시킵니다.

30분마다 20밀리리터의 완충제가 들어 있는 페트리 접시에서 1밀리리터의 현탁액을 회수하여 바이러스 에어로졸을 수집하세요. 필터를 제거하고 실험 후 대조 실험을 진행하세요. 실험 중 30분마다 샘플을 채취하여 각 실험당 8개의 qRT-PCR 및 적정 샘플을 얻으세요.

임핑저 실험에서는 3시간 실험 종료 시 한 번만 적정 샘플을 채취합니다. 채취된 샘플 중 800마이크로리터를 qRT-PCR 분석용으로, 나머지 200마이크로리터를 바이러스 적정에 사용하세요. qRT-PCR 샘플을 액체 질소에 급동하여 80도에서 보관합니다.

바이러스 적정 샘플은 플라크 분석법으로 즉시 처리합니다. 표면 생존 가능성 분석 결과, 모든 시험 코팅이 바이러스를 성공적으로 비활성화했으며, 첫 5분 이내에 상당한 감소가 관찰되었습니다. 구리 기반 표면 코팅인 B4는 감염성 개체수를 5분 만에 3자릿수 감소시키고, 15분 만에 100 플라크 형성 단위 미만으로 완전 비활성화에 도달했습니다.

A6 코팅은 25분 이내에 완전한 바이러스 비활성화를 달성했고, VS B는 60분 이내에 완료되었습니다. VS 코팅은 시험 재료 중 가장 느린 비활성화율을 보였습니다. 연구된 사전 필터 BP6, S11, FMR5는 감염성 바이러스 수를 동일하게 줄이는 데 효과적이었으며, 필터 없이 대조군을 통과하는 데 비해 1.5배에서 2자릿수 증가했습니다.

GF2 필터는 바이러스 부하를 최소 6자릿수 이상 낮추는 우수한 성능을 보였으며, 검출 한계 내에서 감염성 phi6 바이러스 플라크는 검출되지 않았습니다. VS B 코팅은 코팅되지 않은 프리필터에 비해 감염성 바이러스 여과 효과에 유의미한 영향을 미치지 않았습니다. qRT-PCR 결과는 프리필터가 바이러스 유전체 복사본 수를 최대 두 자릿수 감소시킨다는 것을 보여주었습니다.

GF2 필터는 무필터 대조군에 비해 최대 4자릿수 정도 감소했습니다. 프리필터와 제어 간의 차이는 처음 30분 동안 미미했지만, 기계적 필터링 효율은 60분 시점보다 증가했습니다. 또한 VS B 코팅 적용은 여과 배지를 통과하는 바이러스 게놈 수에 측정 가능한 영향을 미치지 못했습니다.

이 프로토콜은 연구자들이 바이러스 비활성화, 여과 효율, 감염성 입자와 총 바이러스 부하 간의 차이를 정량화할 수 있게 합니다. 주요 과제는 공기 흐름 중 바이러스 표면과의 접촉 시간이 매우 짧다는 점으로, 이는 항바이러스 코팅의 효과를 제한합니다. 향후 연구에서는 코팅과 자외선을 결합하거나 실제 환기 시스템과 다양한 바이러스에서의 성능을 시험하는 방안을 탐구할 수 있습니다.