Neuroactive 대리점 지속 배달 Microinfusion 시스템의 구축 및 주입.

안녕하세요, 제 이름은 Miles Cunningham입니다. Ryan O'Connor, Sydney Wong과 함께 신경 활성 물질의 지속적인 전달을 위한 미세 주입 시스템 구축 방법을 시연하겠습니다. 본 연구는 하버드 의과대학 McLean Hospital의 신경 재구성 연구실에서 수행되었습니다.

Sydney rbe Foundation과 Narsad의 아낌없는 지원에 감사드립니다. 본 연구팀은 기존의 전달용 캐뉼라보다 팁 직경이 5배에서 10배 더 작은 풀드(pulled) 붕규산 유리 마이크로 캐뉼라를 통해 신경 활성제를 뇌의 특정 부위에 안정적으로 전달할 수 있음을 확인하였습니다. 이 슬라이드에서는 일반적으로 사용되는 스테인리스강 주입 캐뉼라와 본 실험실에서 제작한 마이크로 캐뉼라를 나란히 비교하여 보여드립니다.

전달 캐뉼라의 크기가 이렇게 감소하면 연구 대상인 뇌 부위의 손상이 획기적으로 줄어듭니다. 실제로 많은 기존 방법들은 관심 영역 내부 또는 주변에 병변을 생성하여 결과의 타당성에 의문을 제기하게 만듭니다. 패널 A에서는 0.32 millimeter 캐뉼라로 인해 발생한 국소 부위의 손상 정도를 확인할 수 있으며, 이는 패널 B의 50 micron 캐뉼라와 대조됩니다. 이 저배율 사진들은 염색하지 않은 Vibram 절편의 습식 표본입니다.

이 동일한 절편들을 h 및 e로 염색한 후 고배율에서 이미징하였습니다. 마이크로 캐뉼라 사용 시 조직 손상이 감소함을 추가로 설명하기 위해, 미세주입 시스템의 구성 요소를 소개합니다. 플랜지를 제거한 스테인리스강 유량 조절기가 장착된 Alzet mini Osmo 펌프, 2~3 cm의 폴리에틸렌 튜브, 맞춤 제작된 BOA 실리케이트 마이크로 캐뉼라, 그리고 28 gauge 가이드 와이어가 사용되었으며, 이것이 이식 준비가 완료된 조립된 미세주입 시스템입니다.

원하는 사양의 마이크로 캐뉼라를 제작하기 위해 여기서는 표준 수직 피펫 폴러(pipette polar)를 사용합니다. 수평 폴러 또한 사용 가능합니다. 가열 요소의 온도와 폴의 장력을 조절하여 보라(Bora) 실리케이트 튜브의 위치를 잡고 고정합니다.

특정 직경과 긴 테이퍼형 샹크 링크를 갖춘 마이크로 캐뉼라를 안정적으로 제작할 수 있습니다. Bora 실리카 튜브를 가열하고 완만한 압력을 가하여 튜브에 원하는 만큼의 굽힘을 줍니다. 이 굽힘은 두개골 상단의 여유 공간을 확보하고 관심 있는 뇌 표적의 깊이에 적합하도록 마이크로 캐뉼라의 팁으로부터 일정 거리 떨어진 지점에 만들어집니다.

이 마이크로 캐뉼라 원위부 튜브의 최종 길이는 굴곡 부분이 약 9~10 mm입니다. 결과가 만족스럽지 않았는지, Ryan은 굴곡 각도를 완벽하게 조정하기 위해 마이크로 캐뉼라를 다시 삽입합니다.

다이아몬드 펜슬을 사용하니 훨씬 더 수월합니다. Sydney는 마이크로 캐뉼라의 원위부가 가장자리에 걸쳐 자유롭게 놓이도록 한 상태에서, 딱딱한 표면 위에 튜브를 단단히 고정하고 굴곡부에서 근위쪽으로 약 5 mm 지점에서 붕규산 유리 튜브를 절단하는 방법을 시연합니다. 그녀는 튜브의 둘레를 따라 금을 긋습니다.

그런 다음 가벼운 압력을 가해 표시된 절단면에서 튜빙을 깔끔하게 꺾어 자릅니다. 시각화를 돕기 위해 캐뉼라의 가늘고 투명한 팁 부분을 유성 잉크로 착색할 수 있습니다. 확대경을 이용한 수술 중에 마이크로 캐뉼라의 팁을 미세 절단 가위로 원하는 직경까지 자릅니다.

팁 직경은 접안렌즈나 현미경으로 확인할 수 있습니다. 방사형 정렬 와이어는 약 3 cm 길이로 절단한 28 gauge 스테인리스 스틸 와이어로 준비합니다. 그 다음 포셉을 사용하여 각 와이어의 끝에 직경 약 2 mm의 작은 갈고리를 만듭니다.

정렬 와이어는 마이크로 캐뉼라 내부의 2~3 cm 길이 폴리에틸렌 튜브와 함께 페트리 접시에 넣습니다. 마이크로 주입 시스템은 대부분의 실험실에서 흔히 사용하는 기구들로 제작할 수 있습니다. 미세 핀셋, 일반 핀셋, 수술용 가위 및 지혈 집게를 소독을 위해 수술용 드레이프 위에 배치합니다.

기구, 미세주입 시스템 구성 요소 및 여러 장의 알루미늄 호일을 표준 오토클레이브를 사용하여 멸균합니다. 유량 조절기를 포장에서 조심스럽게 꺼내 멸균 페트리 접시에 놓습니다. 지혈집게로 유량 조절기를 단단히 고정한 후, 가위를 사용하여 스테인리스 스틸 조절기 튜브에서 플라스틱 플랜지를 제거합니다.

미니 삼투압 펌프를 포장지에서 꺼내 멸균 페트리 접시에 놓습니다. 스테인리스 스틸 튜브를 폴리에틸렌 튜브에 약 2~3 mm 정도 삽입하고, 광경화 에폭시를 사용하여 두 튜브를 함께 밀봉합니다. 정밀한 작업에는 본 연구실의 Lummi bond를 사용하며, 1 CC 주사기에 Lummi bond를 채운 후 27 gauge 바늘을 도포기로 사용합니다. 밝은 빛 아래에서 Lummi bond는 단 몇 초 만에 경화됩니다.

미니 삼투압 펌프는 펌프를 수직으로 세운 상태에서 제조사에서 제공한 충전용 바늘을 사용하여 조심스럽게 주입하여 채웁니다. 펌프가 완전히 채워졌는지 확인하고 결함이 없는지 보장하기 위해, 펌프에 주입되는 액체의 부피를 관찰하거나 충전 전후의 펌프 무게를 측정하는 것을 권장합니다. 펌프의 재사용은 권장하지 않습니다.

폴리에틸렌 튜브가 부착된 전체 모듈레이터를 미니 삼투압 펌프 내에 삽입합니다. 폼 모듈레이터를 삽입함에 따라 펌프 내부의 유체가 폴리에틸렌 튜브로 밀려 들어갑니다. 유체가 채워진 폴리에틸렌 튜브의 초기 거리를 기록하며, 39 °C의 멸균 식염수에서 12시간 동안 배양하며 펌프를 활성화한 후 이 거리가 증가하는지 관찰해야 합니다.

활성화된 미니 삼투압 펌프를 멸균 식염수에 담그면, 미세 주입 시스템 구축의 최종 단계에 필요한 공기가 없는 환경이 조성됩니다. 펌프에 들어있는 것과 동일한 용액을 채우고 소구경 플라스틱 튜브를 장착한 주사기를 사용하여, 폴리에틸렌 튜브의 채워지지 않은 부분에서 공기를 밀어냅니다. 이때 마이크로 캐뉼라 내부의 공기까지 모두 제거해야 함에 유의하십시오.

마찬가지로, 폴리에틸렌 튜브의 원위단은 미세 핀셋으로 약간의 확장이 필요할 수 있으며, 그 후 마이크로 캐뉼라의 근위단을 삽입합니다. 이제 전체 시스템 내에 공기나 데드 스페이스(dead space)가 없는 상태가 되며, 식염수 배스에서 꺼내 멸균 거즈로 물기를 닦아낼 수 있습니다. 그다음 Luma bond를 도포하여 마이크로 캐뉼라를 폴리에틸렌 튜브에 고정합니다. 미니 삼투압 펌프의 유속을 약 절반으로 줄이기 위해, 멸균된 뜨거운 파라핀을 작은 페트리 접시에 붓고 미니 삼투압 펌프의 근위측 절반을 잠시 담급니다.

과잉 파라핀을 닦아내고 마이크로 주입 시스템을 멸균 식염수에 다시 넣어 수술 전까지 보관합니다. 수술적 이식 직전에 가이드 와이어를 마이크로 캐뉼라의 굽은 부분에 부착합니다.

가이드 와이어의 세로축을 뇌 조직에 진입할 마이크로 캐뉼라 부분과 일직선으로 맞춘 후 루몬(lumon)으로 고정합니다. 해당 위치에서 마이크로 주입 시스템을 정위 고정 장치의 매니퓰레이터에 배치할 수 있습니다.

가이드 와이어는 매니퓰레이터 암 클램프로 고정하고, 펌프는 멸균 봉합사 루프를 이용해 위에서 묶어 고정합니다. 이렇게 하면 펌프의 무게를 지탱할 수 있으며, 포셉으로 가이드 와이어를 조심스럽게 구부려 마이크로 캐뉼라를 두개골 표면에 완벽하게 수직으로 정렬할 수 있습니다. 그 후 표준 정위 고정술 절차를 사용하여 미세 주입 시스템을 이식합니다. 보엘 튜빙(boel tubing)은 접착제를 사용하여 두개골 표면에 고정합니다.

저프로파일 페데스탈을 제작하기 위해 den mat Jaron을 사용합니다. 준비 부위 위로 연장된 과잉 가이드 와이어는 페데스탈 표면과 평평하게 절단합니다. 고속 드릴에 부착된 커팅 휠을 사용하여 미니 삼투압 펌프를 동물의 견갑골 사이 피하에 배치할 수 있습니다.

본 방법은 기존 기술에 비해 여러 가지 장점을 제공합니다. 실험 동물의 종과 연령에 맞게 맞춤 제작이 가능합니다. 실리카 튜브는 동물 두개골의 표면에 밀착되도록 성형할 수 있습니다.

따라서, 안전한 저프로파일 고정이 가능하고 대형 두개골 페데스탈의 필요성을 배제함으로써, 유선형 마이크로인퓨전 페데스탈 위로 수술 부위를 쉽게 봉합할 수 있습니다. 이를 통해 감염 위험과 동물의 불편함을 줄일 수 있으며, 시스템을 두개골에 고정하는 데 필요한 표면적도 줄어듭니다. 결과적으로, 더 큰 페데스탈로 인한 간섭 없이 추가 또는 후속 절차를 수행할 수 있습니다. 무엇보다 중요한 점은, 이 방법이 주입 부위의 국소 환경에 대한 침습성과 외상을 줄여 관찰자 효과를 최소화한다는 것입니다.

이는 능동적 관찰이 관찰 대상 현상에 일으키는 변화를 의미합니다.