인간 배아 줄기 세포에서 Mitochondrial 복잡한 활동에 대한 탐색

미토콘드리아는 대사와 에너지 생산부터 세포 사멸 프로그램, 스테로이드 호르몬 합성에 이르기까지 세포 생리에서 수많은 역할을 수행합니다. 기본적인 세포 기능과 질병 모두에서 미토콘드리아가 갖는 중요성에도 불구하고, 인간 배아줄기세포 및 그 분화 후손 세포 내 미토콘드리아의 기능에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 본 영상에서는 인겔(Ingel) 활성 분석법을 사용하여 인간 배아줄기세포의 미토콘드리아 호흡쇄 복합체를 분석하는 방법을 보여드리겠습니다.

안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 병리학 및 실험의학과의 Michael Tetel 교수 연구실 소속 Ivan OV입니다. 오늘은 인간 배아줄기세포의 미토콘드리아 호흡 복합체 기능을 평가하는 절차를 보여드리겠습니다. 이 젤 내 활성 측정 절차에는 인간 배아줄기세포로부터 조 미토콘드리아 팰릿을 분리하는 과정, 고해상도 clear native polyacrylamide 젤 전기영동을 통해 산화적 인산화 시스템의 미토콘드리아 복합체를 분리하는 과정, 그리고 이어지는 젤 내 활성 측정 단계가 포함됩니다.

이제 시작하겠습니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 인간 배아줄기세포에서 미토콘드리아를 분리하는 것입니다. 본 분석에서는 피더 프리(feeder-free) 조건에서 마트리젤(matrigel)이 코팅된 플레이트에서 배양한 인간 배아줄기세포를 사용하겠습니다.

인간 amry 줄기세포에서 미토콘드리아를 수집하기 위해, 먼저 따뜻한 1X PBS pH 7.4로 세포를 세척한 다음 5분 동안 트립신 처리(trypsinization)를 수행합니다. 6웰 플레이트의 웰당 1 mL의 1X trypsin을 사용할 수 있습니다. 5분 후, 1 mg/mL의 트립신 억제제가 포함된 1X PBS를 동일한 부피로 첨가하여 반응을 중단시키고 세포를 수확합니다.

수집한 세포를 상온에서 200 ×g로 5분간 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, 1 × protease inhibitor가 포함된 갓 제조한 칵테일이 들어있는 0.8 ~ 1.7 mL의 ice cold mitochondria isolation buffer에 펠릿화된 세포를 다시 현탁합니다. 사용하는 버퍼의 양은 얻어진 세포 펠릿의 크기에 따라 달라집니다. 펠릿을 재현탁한 후, 얼음 위에서 약 10분간 배양합니다.

배양 후 호모게나이저(homogenizer)를 사용하여 세포를 파쇄하며, 이때 약 40~50회 정도 반복합니다. DOD 세포의 일부를 트라이판 블루(trypan blue)로 염색하여 광학 현미경으로 관찰함으로써 균질화가 완전히 이루어졌는지 확인할 수 있습니다. 그 모습은 다음과 같아야 합니다.

이것은 다운즈(downs)를 사용하여 50회 스트로크한 후의 첫 번째 모습입니다. 이것은 80회 스트로크한 후의 두 번째 모습입니다. 세포가 균질화되면, 4 °C에서 20,000 ×g로 10분 동안 원심분리하십시오. 이를 통해 핵과 더 큰 세포 파편이 포함된 조밀한 미토콘드리아 펠렛을 얻을 수 있습니다.

펠릿을 수집하기 전에, 이후의 펠릿 무게를 추정하기 위해 수집 튜브의 무게를 측정하고, 상층액을 따라내어 버린 다음, 침전된 조 미토콘드리아 펠릿의 무게를 측정해야 합니다. 이 시점에서 튜브의 무게를 빼면 다음 단계에서 보여줄 펠릿 가용화 단계를 진행할 수 있습니다. 조 미토콘드리아 펠릿을 가용화하기 위해, 먼저 펠릿을 얼음에 유지하며 35 µL의 차가운 가용화 버퍼와 함께 볼텍싱하는 것으로 시작합니다.

상세 정보가 제공된 펠렛 20 mg당 사용되는 버퍼 화합물은 동봉된 서면 프로토콜에 명시되어 있습니다. 볼텍싱 후 가용화 버퍼를 첨가하고 디지토닌(digitonin)을 넣기 전, 재현탁된 펠렛을 고속 원심분리에 적합한 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 펠렛 무게 20 mg당 10% (w/v) 디지토닌 20 µL를 첨가하고 튜브를 튕겨 섞어줍니다. 충분히 혼합된 후 미토콘드리아 펠렛을 얼음 위에서 5~10분 동안 배양합니다. 단백질을 가용화하기 위해 디지토닌 대신 n-dodecyl-β-D-maltoside(DDM) 또는 Triton X-100을 사용할 수 있습니다.

계면활성제의 종류와 양은 얼음 위에서 배양한 후 미토콘드리아 복합체의 상위 복합체(supra complexes) 또는 다량체 형태의 형성에 영향을 미칠 수 있습니다. 펠렛이 가용화되면 4 °C에서 100,000 ×g로 15분 동안 원심분리한 후, 투명한 상층액을 수집합니다. 이제 미토콘드리아의 네이티브 구배 겔 전기영동을 위해 상층액을 구배 겔에 로딩할 준비가 되었습니다.

3.5% 스태킹 젤(stacking gel)과 5~13% 아크릴아마이드 구배 젤(acrylamide gradient gel)의 사용을 권장합니다. 젤을 제조하기 위해, 서면 프로토콜에 기술된 대로 아크릴아마이드-비스-아크릴아마이드 혼합물을 사용하겠습니다. 아크릴아마이드-비스-아크릴아마이드 용액은 미리 제조하여 4°C의 암소에 보관합니다.

Acrylamide과 bis acrylamide는 분말 및 액체 상태 모두에서 독성 화학 물질이므로, 이를 다룰 때 특별한 주의를 기울여야 합니다. Acrylamide bis acrylamide 용액을 1.5 molar 6-aminohexanoic acid와 75 millimolar olet(pH 7.0)으로 구성된 3x gel buffer의 일정량과 혼합합니다. buffer에 첨가하는 acrylamide bis acrylamide 용액의 양은 gradient gel 제작 시 설정하는 gel의 퍼센트 농도에 따라 달라집니다.

4% 혼합액 하나와 13% 혼합액 하나를 만들고, 스태킹 젤(stacking gel)은 3.5% 혼합액으로 준비합니다. 13% 혼합액에 글리세롤을 추가하는 것을 잊지 마십시오. 세 가지 혼합액이 모두 준비되면, 각 혼합액에 적절한 양의 과황산암모늄(ammonium per sulfate)과 TEMED를 첨가하고 이를 그라디언트 형성 캐스팅 챔버(gradient former casting chamber)에 붓습니다.

챔버의 왼쪽 부분에는 5% 혼합액이 들어있습니다. 챔버의 오른쪽 부분에는 소형 자석 교반 바와 함께 13% 혼합액이 들어있습니다. 챔버의 오른쪽 부분을 열어 겔을 붓기 시작합니다.

그런 다음 즉시 챔버의 왼쪽 부분을 열어 5% 용액과 13% 용액을 혼합하여 구배를 형성합니다. 중합 후 겔의 경계선이 날카롭고 직선으로 형성되도록 겔 상단에 소량의 이소프로판올을 추가합니다. 약 1시간 후 구배 겔의 중합이 완료되면, 이소프로판올을 제거하고 3.5 스태킹 겔을 장치에 붓고 겔 콤을 삽입합니다.

약 4~7°C의 저온실에서 젤을 조립하고 전기영동을 수행하겠습니다. 이 젤을 실행하기 위해 두 가지 서로 다른 완충액을 사용합니다. 양극 챔버에는 25 millimolar hydrochloric acid pH 7.0이 포함된 완충액을 사용합니다.

음극 완충액은 50 mM Tris, 7.5 mM HCl, 0.02% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside(DDM) 및 0.05% (w/v) desoxy cholate (pH 7.0)를 포함합니다. 방금 제작한 겔에서 전기영동할 상층액을 준비하기 위해, 최종 농도가 5% (w/v) glycerol 및 0.01% (w/v) Ponto S가 되도록 로딩 완충액을 추가합니다. 일반적으로 glycerol과 Ponto S가 포함된 10x 스톡 용액을 상층액에 직접 첨가합니다.

이제 젤 샘플을 젤에 로딩할 준비가 되었습니다. 레인당 20 ~ 40 mg의 조 mitochondrial 단백질이 포함된 부피로 젤 웰을 로딩합니다. 로딩 직후, 젤을 100 V에서 전기영동합니다.

시료가 스태킹 젤(stacking gel)에 진입하면, 전류를 15 milliamps로 제한한 상태에서 전압을 500 volts까지 높일 수 있습니다. 일반적으로는 70 to 100 volts에서 밤새도록 젤을 전기영동하지만, 붉은색 zos 염료의 선명한 라인이 젤 전면(gel front)에 도달하면 전기영동을 중단합니다. 젤 실행이 완료되었으므로, 이제 젤 내에서 서로 다른 단백질 복합체의 활성을 직접 분석할 수 있습니다.

각 분석의 배양 시간은 단백질 가용화 효율과 웰당 로딩된 시료의 양에 따라 달라집니다. 일반적으로 복합체 1, 4, 5는 복합체 2, 3보다 더 강한 신호를 나타냅니다. 따라서 복합체 2와 3의 염색 시간은 더 길게 설정해야 합니다.

복합체 활성을 테스트하려면 각 복합체에 맞는 특정 버퍼를 사용해야 합니다. 개별 버퍼의 성분은 서면 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. 이제 In-gel 활성 분석을 각각 수행하기 위해 겔의 개별 레인을 절단하겠습니다.

복합체 5를 제외한 모든 복합체의 경우, 겔 슬라이스를 각각의 버퍼에 넣고 실온에서 수 시간 동안 배양합니다. 배양 후, 50% methanol과 10% acetic acid에서 15~45분 동안 겔을 고정합니다. 고정된 겔은 10% acetic acid에 보관합니다.

여기에서 복합체 1의 염색 결과가 어떻게 나타나는지 확인할 수 있습니다. 겔 슬라이스 내의 짙은 보라색 밴드 하나가 복합체 1에 해당합니다. 투명한 겔을 사용하면 미토콘드리아 복합체 활성으로부터 밀도 측정을 수행하고 비교 분석을 진행할 수 있습니다.

고밀도 세포 분석 후, 일반적으로 겔 슬라이스를 건조하여 장기 보관하거나, 고품질 이미지를 얻기 위해 스캐닝을 수행합니다. 복합체 2는 복합체 3 및 복합체 4와 동일한 보라색으로 염색됩니다. 두 복합체 모두 오렌지색 또는 황색의 염색 밴드를 나타냅니다. 다음은 복합체 2, 3 및 4의 염색 활성 예시입니다.

지금까지 인간 배아줄기세포에서 추출하고 네이티브 겔 전기영동을 포함한 고해상도 방법을 통해 분리한 미토콘드리아 삼출성 활성 복합체의 활성을 분석하는 방법을 살펴보았습니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다. 시청해주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.