호중구 격리 프로토콜

호중구 분리 프로토콜. 이 절차는 원심분리기와 바이알을 사용하여 전혈 샘플에서 백혈구를 추출하는 과정입니다. 볼텍스 믹서, 바늘 및 주사기, 주사기 필터가 필요합니다.

Millipore 브랜드 MX gv 0.22 µm 재질을 사용합니다. Hanks 균형염 용액(HBSS)을 이용한 중성구 분리에는 두 종류의 HBSS 용액이 필요합니다. 염화칼슘이 포함된 HBSS는 human serum albumin 용액을 제조하는 데 사용됩니다.

염화칼슘이 포함되지 않은 HBSS를 사용하여 호중구를 부유시키고 세척합니다. 이 과정에서 적절한 HBSS 용액을 사용하도록 특별히 주의하십시오. 휴먼 세럼 알부민 또는 HSA는 pH와 삼투압을 유지하는 혈장 내 단백질입니다.

bovine serum amalgamate red cell lysis buffer를 사용하지 마십시오. 이 제품은 Roche Diagnostics에서 제조하며, neutrophil Isolation Media NIM Cedar Line Labs Lymph light Poly separation media는 빛으로부터 보호하고 냉장 보관해야 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 모든 시약은 사용 시 실온 상태여야 합니다.

실험 시작 1시간 전에 냉장고에서 시약을 꺼내십시오. 호중구 분리를 위한 H-B-S-S-H-S-A 용액을 준비하십시오. 염화칼슘이 포함된 HBSS를 바이알에 피펫으로 분주하십시오.

주사기로 HSA를 흡입합니다. 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 주사기 바늘을 제거하고 필터로 교체합니다.

필터를 통해 HSA를 HBSS 바이알에 주입하고 볼텍스로 두 번 섞습니다. 다른 재료들이 준비되어 실온 상태가 되면, 전혈 약 15 milliliters를 채취합니다. 이를 통해 10⁸ neutrophils가 포함된 10 to 15 milliliters의 시료를 얻을 수 있습니다. 기증자는 혈액 샘플을 기증하기 전 24시간 동안 알코올이나 일반 의약품을 섭취하지 않아야 합니다.

이들은 분리 과정을 방해할 수 있습니다. 전혈은 제조사의 지침에 따라 혈액 9분량에 K₃EDTA sodium citrate 또는 heparin 1분량을 첨가하여 항응고 처리할 수 있습니다. 본 절차에서는 다음 단계들이 설명됩니다.

혈장과 단핵구를 분리하여 제거합니다. 적혈구를 용해하여 적혈구가 제거된 호중구 층을 분리 및 획득하여 호중구를 1차 분리합니다. NIM 층에서 호중구를 획득합니다.

원심분리관에 분리 배지 5 mL를 수집합니다. 분리 배지를 튜브 하단에 배치하면, 원심분리 시 혈액이 배지를 통과하여 아래로 강제로 이동하므로 필터 역할을 하게 됩니다. 깨끗한 분리를 위해 NIM 위에 혈액 5 mL를 조심스럽게 층을 이루어 쌓습니다.

용액이 섞이지 않도록 매우 주의하십시오. 원심분리 시 혼합되는 것을 방지하기 위해, 피펫 팁을 분리 겔(resolving media) 표면에 가깝게 대고 이 단계를 천천히 그리고 조심스럽게 수행하십시오. 용액을 500 RCF에서 35분 동안 원심분리하십시오.

20~25°C에서 혈액은 6개의 뚜렷한 층으로 분리되어야 합니다. 이 6개 층은 혈장, 단핵구, 분리 매질, 호중구, 추가 분리 매질, 그리고 바닥 부분의 적혈구 펠렛으로 구성됩니다. 만약 이 6개 층이 명확하고 뚜렷하게 구분되지 않는다면, 분리 과정이 정밀하게 이루어지지 않은 것이므로 다시 수행해야 합니다.

분리가 제대로 되지 않는 일반적인 원인으로는 오래된 분리 배지, 공여자가 지난 72시간 이내에 알코올을 섭취했거나 Tylenol 또는 aspirin과 같은 다른 약물을 복용한 경우가 있습니다. 혈장, 단핵구 및 분리 배지를 조심스럽게 제거하여 버립니다. 이 층들을 밀폐 가능한 튜브에 넣고 주의해서 버리십시오. 최대한 많은 호중구를 회수하기 위해, 호중구 층과 호중구 아래의 모든 분리 배지를 깨끗한 원심 분리관으로 조심스럽게 피펫팅하여 옮깁니다.

아래 층의 분리 배지를 일부 함께 포함하는 것이 가장 간편할 때가 많습니다. 바닥의 펠릿(pallet)이 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 두 번째 선언, 호중구 층을 정제합니다.

칼슘이 포함되지 않은 HBSS를 사용하여 호중구 용액을 10 milliliters로 희석합니다. 튜브를 몇 번 뒤집어 세포를 부유시킨 후, 호중구 용액을 원심 분리합니다.

350 RCF에서 10분간 원심분리합니다. 20~25°C에서 호중구와 잔류 적혈구가 포함된 붉은색 펠렛이 튜브 바닥에 형성되어야 합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다.

주의하십시오. 적혈구를 용해할 때 바닥의 펠렛이 흐트러지지 않도록 하십시오.

이제 시료 내의 적혈구를 용해시켜 제거해야 합니다. 남아 있는 적혈구를 용해하려면, 튜브에 적혈구 용해 버퍼 2 mL를 첨가하여 재부유시킵니다. 펠릿을 부유시킨 후, 바이알을 3~4 설정으로 볼텍싱합니다.

중성구(neutrophils)가 활성화될 수 있으므로 볼텍스(vortex) 설정을 4 이상으로 높이지 마십시오. 펠렛(pellet)을 녹이기 위해 수 초 동안 볼텍싱하거나 짧게 반복하여 볼텍싱해야 할 수도 있습니다. 용해액(lysis solution)을 250 RCF에서 5분 동안 원심분리하십시오.

시료의 손상을 최소화하기 위해 소프트 스타트(soft start) 옵션을 사용하십시오. 피펫으로 상층액을 제거합니다. 용해 과정을 반복합니다.

필요한 경우, 호중구 현탁액을 분산시키기 위해 각 튜브에 calcium이 없는 HBSS 500 microliters를 추가합니다. 펠릿을 3에서 4 설정으로 볼텍싱하고, calcium이 없는 HPSS로 10 milliliters까지 희석한 후 원심분리합니다. 호중구를 250 RCF에서 5분 동안 원심분리한 뒤 상층액을 흡입하여 제거합니다.

펠렛을 250 µL의 HSA 포함 HBSS 용액에 다시 현탁합니다. 일반적으로 mL당 2×10⁶개의 호중구를 수집합니다.