포유 동물 세포를 Trypsinizing 및 Subculturing

조직 배양 기술은 세포 생물학 분야에서 널리 응용되어 왔습니다. 하지만 배양된 세포가 건강한 상태를 유지하기 위해서는 정기적인 관리가 필요합니다. 세포가 합류도(confluency)에 도달하면, 계대 배양(subculture 또는 passage)을 수행해야 합니다.

그렇게 하지 않으면 성장이 저해되고 결국 세포 사멸로 이어집니다. 본 영상에서는 부착성 및 부유성 세포주 모두에 대한 조직 배양 세포 유지 방법을 시연합니다. 안녕하세요, 저는 이스트 테네시의 Molecular Pathology Laboratories Network 내 Dr.LAN's Laboratory의 Ricky입니다.

오늘은 부유 세포와 부착 세포를 계대 배양하는 두 가지 기술을 보여드리고자 합니다. 세포 플레이트를 계대 배양하기 위해, 5 mL의 조직 배양 배지가 들어 있는 60 mm 페트리 접시 또는 25 cm² 조직 배양 플라스크에서 컨플루언시(confluency) 상태까지 성장시킨 일차 배양 세포로 시작하겠습니다.

먼저 멸균 피펫을 사용하여 일차 배양액의 모든 배지를 제거합니다. 그다음, 다음 단계에서 첨가할 트립신 효소의 활성을 저해할 수 있는 잔류 태아 송아지 혈청을 제거하기 위해, 칼슘과 마그네슘이 없는 37 °C HBSS 소량을 사용하여 부착된 세포 단층을 한두 번 세척합니다.

다음으로, 부착된 세포층이 덮일 정도로 충분한 양의 따뜻한 trypsin EDTA 용액을 배양 접시에 추가합니다. 그 후, 플레이트를 37 °C 가온 트레이에 1~2분 동안 놓아둡니다. 배양이 끝나면, 플레이트 바닥을 평평한 표면에 가볍게 두드려 세포를 떼어냅니다.

도립 현미경으로 배양 상태를 확인하여 세포가 둥글게 말려 있는지 확인하십시오. 이는 세포가 표면에서 떨어져 나왔음을 나타냅니다. 세포가 충분히 떨어지지 않았다면, 플레이트를 워밍 트레이에 1~2분 더 두십시오. 현미경 관찰 후, 디쉬를 완전 배지로 헹구고 부유액을 2 mL의 완전 배지가 들어 있는 15 mL 원심관에 피펫으로 옮기십시오.

세포를 원심 분리하여 펠렛으로 만든 후, 완전 배지에 펠렛을 재현탁합니다. 이제 적절하게 라벨링된 각 새 플레이트에 동일한 부피의 세포 현탁액을 첨가합니다. 또는, 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 센 후 원하는 밀도로 희석하여 각 플레이트에 특정 수의 세포를 첨가할 수 있습니다.

모든 플레이트에 계대배양 날짜와 계대 횟수를 반드시 표시하십시오. 세포 현탁액을 추가한 후, 각 새로운 배양물에 신선한 배지 1 mL를 넣으십시오. 이제 습도가 유지되는 37 °C, 5% CO2 배양기에 플레이트를 배양하십시오.

세포를 하룻밤 동안 배양한 후, 플레이트에 신선한 배지를 추가하고 다시 37°C에 넣으십시오. 플레이트 내 세포가 합류(confluency) 상태에 도달하면, 이 절차를 반복하여 플레이트를 다시 계대 배양할 수 있으며, 필요에 따라 계대 배양을 계속하십시오. 이제 부유 배양 세포를 계대 배양하는 방법을 보여드리겠습니다.

부유 배양 세포의 패키징은 부착 세포보다 간단합니다. 부유 배양물을 패키징하기 전에, 세포가 뭉쳐 부유액 내에 덩어리가 지고 플라스크를 흔들었을 때 배지가 탁하게 보일 때까지 2~3일마다 먹이를 공급하여 합류도(confluency)에 도달할 때까지 유지해야 합니다.

이를 위해, 플라스크 바닥에 가라앉은 세포들이 흐트러지지 않도록 주의하며 배양기에서 부유 세포가 담긴 플라스크를 꺼냅니다. 무균적으로 플라스크 내 배지의 약 3분의 1을 제거하여 버리고, 이를 37 °C로 예열된 배지로 동일한 부피만큼 채웁니다. 배지를 교체한 후, 플라스크를 가볍게 돌려 섞어준 다음 37 °C, 5% CO2 조건의 배양기로 다시 넣습니다.

플라스크 내 배지 부피가 15 mL 미만인 경우, 세포와 배지의 접촉을 높이기 위해 플라스크를 수평 상태로 배양하십시오. 그렇지 않은 경우, 배지를 공급하지 않는 날에는 플라스크를 수직으로 세워 배양할 수 있습니다. 플라스크를 흔들어 세포를 재부유시켜 상태를 확인하십시오.

배지에서 대사 성장이 원활함을 나타내는 색상 변화가 있는지 반드시 관찰하십시오. 세포 배양액이 1mL당 약 250만 개의 세포로 합쳐져 밀도가 높아지면(confluent), 계대 배양을 진행할 수 있습니다. 다시 한번, 부착 배양 및 부유 배양 모두에 대해 배양 세포를 계대 배양하는 방법을 보여드렸습니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 모든 실험에서 좋은 결과 얻으시길 바랍니다.