Immunoblot 분석

흔히 웨스턴 블로팅(Western blotting)이라 불리는 면역 블로팅(Immuno blotting)은 단백질 샘플 내에서 다클론 또는 단클론 항체에 의해 인식되는 특정 항원을 식별하는 데 사용됩니다. 이 절차는 일반적으로 1차원 또는 2차원 젤 전기영동 후에 수행되며, 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 전이시키는 과정을 포함합니다. 이후 이 막을 효소와 직접 또는 간접적으로 결합된 1차 및 2차 항체와 함께 배양하고, 색상 또는 형광 기질 반응을 이용하여 막 위의 단백질 항원을 시각화합니다.

본 영상에서는 면역 블로팅 과정의 단계별 시연을 제공합니다. 안녕하세요, 저는 UVPI의 Sean Gallagher이며, 이곳 KE Graduate Institute의 단백질체학 센터와 협력하고 있습니다. 오늘은 면역 블로팅 분석법을 보여드리겠습니다.

이 과정은 단백질 분리, 단백질의 막 전이, 면역 프로빙, 그리고 발색 및 화학 발광 기질을 이용한 시각화를 포함한 여러 단계로 구성됩니다. 이제 시작하겠습니다. 면역 블로팅 절차를 시작하기 전에, 먼저 소형 또는 표준 크기의 1차원 또는 2차원 젤을 이용한 전기영동으로 단백질 시료를 분리해야 합니다.

항원 샘플을 준비하여 겔의 웰에 로딩하고, 겔 웰 중 하나 이상에 미리 염색된 단백질 또는 비오틴화 단백질 분자량 표준물을 포함시킵니다. 이러한 단백질 마커는 막으로 전사되어 면역 염색 후 막의 방향과 단백질 크기를 편리하게 나타내 줍니다. 전기영동이 완료되면 면역 블롯을 조립할 준비가 된 것입니다.

이뮤노 블롯(immuno blot)을 조립하려면, 먼저 겔 샌드위치를 분해하고 스태킹 겔(stacking gel)을 제거합니다. 겔을 실온의 트랜스퍼 완충액(transfer buffer)에서 30분 동안 평형화합니다. 이러한 평형화 과정은 트랜스퍼 도중 겔의 크기가 변하는 것을 방지하기 위해 필요합니다. 겔이 평형화되는 동안, 플라스틱 트랜스퍼 카세트가 충분히 잠길 정도로 트랜스퍼 완충액을 채운 넓은 트레이에서 트랜스퍼 샌드위치 조립을 시작합니다. 이제 플라스틱 트랜스퍼 카세트의 하단부에 스카치브라이트 패드(scotch bright pad) 또는 스펀지를 놓습니다.

그런 다음 겔과 동일한 크기로 자른 여과지 한 장을 준비합니다. 이를 전이 버퍼로 미리 적신 후 스카치 브라이트 패드 위에 놓습니다. 30분간의 겔 평형화가 완료되면, 여과지 위에 겔을 올립니다.

시험관이나 유리 막대를 겔 표면 위로 부드럽게 굴려 겔과 여과지 사이에 있는 기포를 제거합니다. 또는 BioRad 키트에 포함된 BioRad 롤러를 사용할 수 있습니다. 여과지, 겔 및 막대를 다룰 때는 반드시 장갑을 착용하십시오.

손의 유분이 전사를 방해할 수 있습니다. 다음으로, 전사 막을 준비하십시오. 막을 겔과 동일한 크기에 각 가장자리당 1~2 mm를 더한 크기로 자릅니다.

그런 다음 멤브레인의 한쪽 끝을 45도 각도로 하여 증류수에 천천히 넣습니다. 그러면 물이 멤브레인으로 스며들어 결국 표면 전체를 적시게 됩니다. 물에 너무 빨리 넣으면 공기가 갇혀 멤브레인에 흰색 반점으로 나타나게 됩니다. 이러한 영역에는 단백질이 전이되지 않습니다.

멤브레인이 완전히 젖으면 10분에서 15분 동안 전사 버퍼(transfer buffer)로 평형화합니다. 이 적심 과정은 니트로셀룰로오스 및 나일론 멤브레인에 적용됩니다. PVDF 멤브레인만 소수성 특성을 가지므로, 단순히 증류수나 전사 버퍼에 담그는 것만으로는 젖지 않습니다.

PVDF 막을 먼저 100% methanol에 1~2초간 담근 후, 전사 버퍼(transfer buffer)에서 10~15분 동안 평형화해야 합니다. 어느 단계에서도 막이 마르지 않도록 주의하십시오.

이런 경우 메탄올로 다시 적신 후 전사 버퍼를 처리하십시오. 멤브레인이 준비되면, 미리 적신 멤브레인을 젤의 상단에 직접 배치합니다. 시험관 유리 막대나 BioRad 롤러를 사용하여 멤브레인 표면을 부드럽게 밀어 젤과 멤브레인 사이의 모든 기포를 제거하십시오.

다음으로 3 mm Watman 필터 페이퍼 한 조각을 적십니다. 그 후 이를 멤브레인 위에 올리고 다시 한번 모든 기포를 제거합니다. 그런 다음 이 필터 페이퍼 위에 스카치브라이트 패드나 스펀지를 하나 더 올립니다.

전사 카세트의 상단부를 고정하여 면역 블롯 샌드위치 조립을 완료합니다. 면역 블롯 샌드위치 조립이 완료되었으므로, 이제 젤의 단백질을 막으로 전사할 준비가 되었습니다. 전사 과정을 시작하려면 전기 영동 전사 탱크를 전사 버퍼로 채우고, 샌드위치가 들어 있는 전사 카세트를 전기 영동 전사 장치에 넣습니다.

멤브레인이 탱크의 양극 또는 양전하 측을 향하도록 샌드위치를 구성하는 것이 중요합니다. 전원 공급 장치의 리드를 전기영동 전이 장치의 해당 양극 및 음극 측에 연결하십시오. 이 특정 기준 블로터에는 냉각용 아이스 블록이 포함되어 있습니다.

이제 젤의 단백질을 멤브레인으로 전기영동 전이시키는데, 냉각 상태에서 50 V로 30~60분 동안 수행하거나 냉장실에서 14 V로 하룻밤 동안 수행합니다. 전이가 완료되면 전원 공급 장치를 끄고 장치를 분해합니다. 그런 다음 블로팅 장치에서 멤브레인을 제거하고 모서리 부분을 잘라 방향을 표시합니다.

이 단계에서 막을 건조시킨 후 밀폐 가능한 플라스틱 백에 넣어 4 °C에서 1년 동안 보관할 수 있습니다. 추가 처리 전, 건조된 PVDF 막은 소량의 100% methanol에 넣어 막을 적셔야 합니다. 그 다음 증류수에 넣어 methanol을 제거합니다.

방향 표시가 완료되면, 젤을 염색하여 전이 효율을 확인하십시오. 전이된 단백질을 시각화하기 위해, cipro ruby를 사용하여 멤브레인을 가역적으로 염색하거나, kamasi blue India ink, naphthol blue 또는 colloidal gold를 사용하여 비가역적으로 염색할 수 있습니다. 이러한 비가역적 염색 절차는 나일론 멤브레인에는 적용할 수 없습니다.

단백질이 막으로 전이되었으므로, 면역 프로빙 및 단백질의 시각적 검출을 진행합니다. 이 단계에서는 막에 고정된 단백질을 특정 항체로 프로빙하여 존재하는 항원을 식별하고 정량합니다. 우선, 20 milliliters의 블로킹 버퍼가 담긴 플라스틱 배양 트레이에 막을 넣으십시오.

일부에서는 백을 사용하기도 하지만, 서로 다른 1차 항체 용액에서 많은 수의 스트립을 처리할 때 특히 유용하므로 트레이가 더 자주 사용됩니다. 다음으로, 밀봉된 멤브레인을 상온에서 오비탈 쉐이커나 로킹 플랫폼으로 흔들어주며 30분에서 60분 동안 배양합니다. 멤브레인이 배양되는 동안 1차 항체와 블로킹 버퍼를 희석합니다.

희석 배수는 경험적으로 결정하지만, 일반적으로 1:100에서 1:1000 사이입니다. 다클론 항체의 경우, 하이브리도마 상청액은 1:10에서 1:100, 단클론 항체가 포함된 마우스 복수액은 1:1000 이상으로 희석합니다. 배양이 완료되면 블로킹 버퍼를 따라 버립니다.

버퍼를 희석된 1차 항체로 교체하고, 다시 실온에서 지속적으로 흔들어주며 30분에서 60분 동안 배양합니다. 다음으로, NITROCELLULOSE 또는 PVDF 필터의 경우 100 mL의 TTBS를, 나일론 필터의 경우 TBS를 사용하여 멤브레인을 흔들어 4회 세척합니다.

멤브레인을 세척하는 동안 매회 10분에서 15분 동안 세척하고, 2차 항체는 블로킹 버퍼에 희석합니다. 2차 항체의 예로는 horseradish peroxidase 또는 alkaline phosphatase, anti IG 접합체, 상용 효소 접합체 등이 있습니다. 2차 항체는 일반적으로 사용 전 1:200에서 1:25,000 비율로 희석합니다.

세척 단계를 마치고 세척액을 폐기한 후, 희석된 horse radish peroxidase 또는 alkaline phosphatase anti IG conjugate를 첨가하고 상온에서 지속적으로 교반하며 30분에서 60분 동안 배양합니다. 30분에서 60분 후, 용기에서 막을 꺼내어 앞서 설명한 TTBS로 각 10분에서 15분씩 총 4회 세척합니다.

세척 과정이 완료되면 시각화 단계를 진행할 준비가 된 것입니다. 하지만 그 전에, 대안적인 면역 프로빙 절차를 시연하겠습니다. 이 대안적인 면역 프로빙 절차는 Vector Labs의 Vector Stain ABC 키트를 기반으로 합니다.

이 방법은 avidin-biotin 복합체를 사용하여 biotin화된 2차 항체에 horseradish peroxidase(HRP) 또는 alkaline phosphatase(AP)를 결합시키는 방식입니다. 오늘은 HRP 키트를 시연하겠습니다. TTBS는 avidin-biotin 시스템의 블로킹 버퍼로 사용하기에 적합합니다.

하지만 나일론 필터의 경우에는 단백질 결합 시약을 권장하는데, 이는 무지방 건조 우유에 잔류 비오틴이 포함되어 있어 면역 분석을 방해하기 때문입니다. 무지방 건조 우유는 블로킹 단계에서만 사용해야 하며, 멤브레인을 블로킹 버퍼가 담긴 오픈 트레이에 넣고 오비탈 쉐이커나 로킹 플랫폼을 사용하여 지속적으로 교반함으로써 평형 상태로 만들어야 합니다. 멤브레인이 평형 상태가 되는 동안 상온에서 30분에서 60분 동안 배양하십시오.

1차 항체 용액을 준비합니다. 고감도 Aden. Biotin 시스템을 사용하는 NITROCELLULOSE 또는 PVDF 막의 경우 TTBS를 사용하십시오.

1차 항체를 포함하는 세라(cera)의 희석 배율은 일반적으로 1:1,000에서 1:100,000 범위입니다. 화학발광법을 사용하는 경우에는 더 높은 희석 배율이 필요합니다. 본 실험에서는 발색법을 사용하여 입증하였습니다.

1차 항체를 5,000배로 희석하여 사용합니다. 평형 도달이 완료되면 블로킹 버퍼를 제거합니다. 그 다음, 멤브레인이 충분히 잠길 정도의 1차 항체 용액을 첨가합니다.

실온에서 30분 동안 부드럽게 흔들어주며 막을 배양한 후, 30분 뒤에 꺼냅니다. 니트로셀룰로오스 막의 경우 TTBS로 5분 간격으로 세 번 세척합니다. 세척 단계 동안, 비오틴화 항체 한 방울을 TTBS 10 milliliters에 희석하여 비오틴화 2차 항체 용액을 준비합니다. 세척 단계가 완료되면 2차 항체 용액을 첨가합니다.

2차 항체와 함께 멤브레인을 반응시키는 동안, 상온에서 천천히 흔들어주며(slow rocking) 30분 동안 배양합니다. 이를 위해 avadon biotin HRPO를 준비합니다. vti stain reagent A 두 방울과 reagent B 두 방울을 10 milliliter에 섞습니다.

니트로셀룰로오스용 TTBS. 2차 항체 반응이 완료되면 실온에서 30분 동안 배양하십시오. 15분 동안 TTBS 또는 TBS로 멤브레인을 3회 세척하십시오.

다음으로, avidan biotin 효소 용액을 막에 첨가하고 실온에서 천천히 흔들어주며 30분 동안 배양합니다. 그 후 TTBS로 10분 간격으로 막을 세 번 세척합니다. 면역 프로빙 과정이 완료되었으므로, 이제 막에 결합된 단백질을 발색 기질로 시각화할 수 있습니다.

마지막 시각화 단계에서는, horseradish peroxidase 기반 면역 검출 절차에 일반적으로 CN dab/ICL 2 및 TMB 기질이 사용됩니다. 면역 프로브 과정 중의 마지막 막 세척을 TTBS로 수행했다면, 실온에서 50 mL의 TBS로 막을 15분 동안 세척하십시오. 이제 막을 발색 시각화 용액에 넣으십시오.

단백질 밴드는 10분에서 30분 사이에 나타나야 합니다. 30분간의 배양 후, 기질 반응 혼합물을 버리고 증류수를 첨가하여 반응을 종료시킵니다. 면역 블로팅은 1차원 또는 2차원 전기영동 후 특정 단백질의 존재를 검출하기 위해 수천 개의 실험실에서 사용하는 다단계 절차입니다.

지금까지 면역 혈액 분석 수행 방법을 살펴보았습니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바라며, 시청해 주셔서 감사합니다.