Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

*C. elegans*는 세포 계보에 대한 지식뿐만 아니라 전체 게놈의 시퀀싱 및 분석을 통해 생성된 방대한 정보 덕분에 매우 유용한 모델 생물입니다. 이 비디오에서는 *C. elegans*에 플라스미드를 미세 주입하는 과정과 형광 현미경을 사용하여 형질 전환 자손을 선택하는 방법을 시연합니다. *C. elegans*는 투명한 다세포 동물로서, 형광 표지 단백질을 발현하는 형질 전환 유전자를 in vivo에서 시각화하는 데 이상적입니다. 안녕하세요, 저는 여기 앨라배마 대학교 생물과학과의 Caldwell 연구실 연구원인 Laura Berkowitz입니다.

저는 앨라배마 대학교 Calwell 연구실의 Adam Knight입니다. 오늘은 형질전환 sea elegance를 생성하기 위한 플라스미드 미세주입(Plasmin Microinjection)의 준비 및 수행 방법을 보여드리겠습니다. 또한, 형질전환 seal elegance 라인을 선택하고 유지하는 방법도 함께 설명하겠습니다. 그럼 시작해 보겠습니다.

미세주입을 시작하기 전에 몇 가지 준비 단계가 있으며, 지금부터 이를 보여드리겠습니다. 먼저, 주입할 플라스미드 DNA를 준비합니다. 두 종류의 플라스미드가 필요한데, 하나는 표적 유전자의 조직 특이적 발현을 인코딩하는 플라스미드이고, 다른 하나는 선택 가능한 형질전환 마커를 제공하는 플라스미드입니다. 이 플라스미드들을 50 nanograms per microliter의 농도로 1:1 비율로 혼합합니다.

다음으로, 주입 시 벌레를 고정하는 데 사용할 어거 패드(auger pads)를 준비합니다. 어거 패드를 만들기 위해 먼저 22 by 50 밀리미터 크기의 커버 글라스 여러 개를 벤치 위에 놓습니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 녹인 2% agros 한 방울을 커버 글라스 하나에 떨어뜨리고, 즉시 두 번째 커버 글라스를 첫 번째 글라스와 90도 각도가 되도록 방울 위에 덮습니다.

에어로겔이 수초 동안 굳을 때까지 기다린 후 상단 커버 글라스를 제거합니다. 납작해진 에어로겔 디스크의 직경은 15에서 20 mm 사이여야 합니다. 패드를 수 시간 동안 또는 하룻밤 동안 완전히 자연 건조시킵니다.

패드가 건조되면 커버 글라스 박스에 넣어 실온에서 보관하십시오. 다음으로, DNA 용액용 니들 로더를 준비합니다. 이를 위해 100 µL 모세관을 가져와 개방형 화염의 중앙에서 가열한 후, 빠르게 당겨 길이를 약 두 배로 늘립니다.

모세관이 식으면 두 부분을 꺾어서 분리합니다. 주입에 사용할 니들 로더를 10~20개 정도 미리 준비하십시오. 마이크로 원심분리 튜브에 세워서 보관할 수 있습니다.

Brack, 조심하세요. 니들 로더의 포인트는 매우 날카롭습니다. 이제 미세 주입 바늘을 제작하겠습니다.

이 바늘들은 내부의 유리 필라멘트가 포함된 특수 모세관으로 제작되었습니다. 이 필라멘트는 DNA 용액의 심지 역할을 합니다. 바늘을 제작하기 위해 Niki PP eight 30 Polar를 사용하며, 열 설정을 24.8로 하여 여러 개의 바늘을 한 번에 뽑아 보관합니다.

여러 개의 니들을 모델링 클레이 스트립 위에 장착할 수 있습니다. 인출된 니들의 팁을 깨뜨리기 위해 작은 커버 글라스 파편이 사용됩니다. 이 파편들은 18 by 18 mm 커버 글라스를 킴와이프로 감싼 후, 여러 조각으로 부서질 때까지 부드럽게 압력을 가하여 준비합니다.

크기가 약 3x4mm인 파편을 사용하십시오. DNA와 바늘을 준비하는 것 외에도, 적절한 단계의 야생형 벌레를 각 발현 벡터 구성물당 2마리씩, 총 50~100마리 정도 준비하십시오.

이제 미세주입 현미경을 설정할 준비가 되었습니다. 현미경 설정을 시작하려면 미세주입 바늘 암 및 홀더에 연결된 헬륨 탱크의 메인 밸브를 엽니다. 가스가 라인으로 유입될 수 있도록 레귤레이터를 잠급니다.

압력을 35 PSI로 맞춘 후, 풋 페달을 사용하여 가스를 배출합니다. 다음으로, 표준 마우스 피펫터 튜브에 니들 로더를 삽입하고 플라스미드 혼합물을 약 1 µL 소량 떨어뜨립니다. 이제 저항이 느껴질 때까지 니들 로더를 미세주입 바늘 끝까지 천천히 삽입합니다.

가볍게 불어 DNA 용액을 배출한 다음 로더를 제거합니다. DNA 로딩이 완료되면, 바늘을 미세주입 암(microinjection arm)의 작은 내부 고무 가스켓 안에 정확히 위치시켜 삽입한 후 조작기 암에 고정합니다. 다음으로, 오거 패드(auger pad)의 한쪽 가장자리에 바늘 절단용 커버 글라스 조각을 놓습니다.

파편과 오거 패드의 전체 표면을 할로우 카본 오일로 덮습니다. 그런 다음 오거 패드를 도립 현미경의 스테이지 위에 놓습니다. 오거 패드가 배치되면 Forex 대물렌즈와 명시야 조명을 사용하여 바늘을 시야 중심에 맞추되, 아직 오일 속으로 내리지는 마십시오.

다음으로 커버 글라스 파편의 안쪽 가장자리를 중앙에 맞춘 후 초점을 잡습니다. 바늘을 오일 속으로 내려 커버 글라스 파편과 동일한 초점 평면에 위치시킵니다. 40 x 대물렌즈로 전환하여 배율을 높인 다음, 파편의 가장자리에 다시 초점을 맞추고 필요한 경우 바늘 끝의 위치를 조정합니다.

이제 주입 바늘의 끝부분을 깨뜨립니다. 풋 페달을 통해 가스를 짧게 분사하는 동시에, 커버 글라스 파편의 가장자리에 바늘을 가볍게 밀어 넣습니다. 그러면 바늘 끝이 충분히 깨져 열리게 됩니다.

바늘 끝에서 작은 액체 방울이 빠져나오거나, 개구부가 너무 커서 액체가 과하게 흐르는 것은 동물을 죽게 할 수 있으므로 바람직하지 않습니다. 바늘이 준비되면 미세주입을 시작합니다. 다음으로, 바늘을 위로 들어 올려 스테이지에서 오거 패드를 제거합니다.

하지만 X축 또는 Y축 위치는 변경하지 마십시오. 스테이지를 바늘 아래에서 밀어내어 제거합니다. 오거 패드를 제거하여 해부 현미경 위에 놓습니다.

오일 표면 아래의 패드로 벌레를 옮깁니다. 벌레가 꿈틀거리면 오거 패드에 닿을 때까지 부드럽게 쓰다듬어 줍니다. 그러면 젖은 벌레가 건조한 오거에 부착됩니다. 벌레가 시야 중심에 오도록 조절하며 오거 패드를 신속하게 다시 스테이지 위에 올려놓습니다.

그 다음 바늘을 벌레와 동일한 초점 평면으로 내립니다. 도립 현미경의 필터를 호프만 조명(Hoffman illumination)으로 전환합니다. 이 대비 필터를 사용하면 벌레의 형태학적 세부 구조를 관찰할 수 있습니다.

40배 대물렌즈를 사용하여, 생식세포 핵의 허니콤 패턴 아래에 있는 벌레 생식샘의 알갱이 형태의 감각 중심에 초점을 맞춥니다. 바늘이 향하고 있는 쪽에 위치한 생식샘을 선택하십시오. 바늘 끝에도 초점이 맞을 때까지 바늘의 위치를 미세하게 조정하십시오.

바늘을 생식선 중앙에 조심스럽게 삽입하고, 짧은 가스 압력을 가해 DNA 한두 방울을 생식선 암(gonad arm)으로 배출하십시오. 충분한 연습과 숙련도가 쌓이면 액체 파동이 원위부 생식선 전체로 퍼지는 것을 관찰할 수 있습니다. 매번 생식선 중앙을 정확히 찌를 수 있게 될 것입니다.

벌레에 주입하는 동안에는 빠르게 작업하는 것이 중요하다는 점을 명심하십시오. 벌레가 쉽게 건조해질 수 있기 때문입니다. 전체 과정은 가급적 1~2분 이내에 완료되어야 합니다.

주입이 완료되면 스테이지에서 오거 패드를 제거하여 해부 현미경 위에 놓습니다. 주입된 벌레 위에 M9 버퍼 1 µL를 직접 도포합니다. 이때 피펫 팁을 할로카브 오일 표면 아래로 담가야 할 수도 있습니다.

완충액이 벌레를 재수화시키면 벌레가 에어로스 패드 표면에서 떠오르게 됩니다. 이때 웜 픽(worm pick)을 사용하여 벌레를 일반 플레이트로 옮기십시오. 이제 주입된 벌레를 Adam에게 전달하며, Adam이 형질전환 라인의 선택 및 유지 방법을 보여줄 것입니다. 주입된 벌레들은 각각 신선한 배지가 도포된 60mm 플레이트로 옮겨져 증식하도록 둡니다.

이 벌레들은 P0 세대에 해당합니다. 일반적으로 주입된 개체들은 후손이 나타날 때까지 20 °C에서 2~3일 동안 배양합니다. 후손이 나타나면 형질전환 벌레의 스크리닝을 시작할 준비가 된 것입니다.

F1 자손에서 형질전환 마커의 발현 여부를 관찰합니다. 이 경우 선택 마커가 형광성이므로 형광 실체 현미경을 사용하여 스크리닝할 수 있습니다. 형광 표지된 각 F1 개체는 새 플레이트에 개별적으로 클로닝합니다.

주입된 P₀는 모든 F₁ 세대 중 단 1~5마리의 형광 후손만을 생성할 수 있습니다. F₁ 자웅동체들이 20°C에서 2~3일 동안 번식하여 후손이 나타날 때까지 기다립니다. F₂ 세대가 준비되면, 이들 중에서도 형질전환 동물이 있는지 관찰합니다. 형질전환 마커를 물려받아 발현하는 F₂ 동물은 안정적 라인으로 간주됩니다.

각 독립적인 안정적 라인은 별개의 라인으로 유지해야 하며, 매 세대마다 여러 마리의 형질전환 동물을 새 플레이트로 옮겨 각 라인을 증식시키십시오. 이 작업은 형광 실체 현미경을 사용하여 수행해야 합니다. 만약 선택 마커가 형광성인 경우, 유전자 복제 수의 변동성을 제어하기 위해 주입된 컨스트럭트당 최소 3개의 독립적인 안정적 라인을 생성하십시오.

지금까지 발현 벡터 구조물을 미세 주입하고, C. elegans를 관찰하며, 안정적인 세포주를 선택하는 방법을 살펴보았습니다. 이것으로 모든 과정을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.