세미 Denaturing 세제 - 아가로 오스 젤 전기 영동에 의해 아밀로이드 집계에 대한 심사

안녕하세요, 저는 MIT 생물학과 Susan Linus 연구실의 대학원생 Randall Hoffman입니다. 오늘은 반변성 세제 아가로스 겔 전기영동, 즉 SDD-AGE에 대해 소개해 드리겠습니다. 저희 연구실에서는 프리온 및 기타 아밀로이드성 단백질을 스크리닝하기 위해 이 기술을 사용합니다.

우리가 사용하는 SDD 연령 측정법은 간단하고 신뢰할 수 있으며, 어떤 수의 샘플이라도 처리할 수 있도록 확장 가능합니다. 아밀로이드(Amyloids)는 SDS에 의한 변성에 매우 강하며, 이를 통해 SDDH를 사용하여 다른 단백질과 분리할 수 있습니다. 하지만 SDDH 데이터만으로는 특정 물질이 아밀로이드라는 것을 확정할 수 없습니다.

이를 위해서는 다른 기술을 사용해야 합니다. 그런 의미에서 제가 보여드리겠습니다. S-D-D-H-S-D-D-H는 수평 DNA 전기영동을 위한 표준 장비를 사용하여 수행할 수 있습니다.

먼저, 겔 캐스팅 트레이를 조립해야 합니다. 장치의 크기는 샘플 수에 따라 달라집니다. 샘플 수가 많을 경우 20 by 24 cm 슬랩과 최대 4개의 50 well 콤을 사용합니다.

겔을 준비하려면 중간 또는 높은 겔 강도의 저 EEO agarose, 1X TAE 버퍼 및 10% SDS 스톡 용액이 필요합니다. 1.5% agarose 용액과 1X TAE를 조제하십시오. 최대한 많은 샘플을 로딩하고 검출을 극대화할 수 있도록 겔을 가능한 한 두껍게 만드는 것이 좋습니다. agarose가 완전히 녹을 때까지 혼합물을 전자레인지로 가열하십시오.

100 XSDS 스톡을 0.1%에 빠르게 첨가하고 소용돌이 모양으로 섞어줍니다. 이 단계에서 일부 시약이 응고되면 핫플레이트 위에서 녹이십시오. 이때 용액이 끓지 않도록 주의하십시오.

SDS를 추가하면 용액에 거품이 쉽게 생겨 넘칠 수 있으므로, 용액이 아직 뜨거울 때 캐스팅 트레이에 붓습니다. 그 후 콤(comb)을 사용하여 이후 겔 전이 과정에서 방해가 될 수 있는 기포를 제거합니다. 겔이 완전히 식고 응고되면, 콤을 조심스럽게 제거하고 겔을 탱크에 넣습니다.

겔을 0.1% SDS가 포함된 1X TAE 용액에 완전히 잠기게 합니다. 이제 샘플을 로딩할 준비가 되었습니다. SDDH에 사용되는 단백질 샘플은 두 가지 중요한 예외 사항을 제외하고는 SDS-PAGE와 동일한 방식으로 준비합니다.

첫째, 응집체가 단백질 단량체로 변성될 수 있으므로 샘플을 가열하지 않도록 주의해야 합니다. 둘째, 단백질 분해를 방지하는 데 주의를 기울이십시오. 본 실험에 사용된 변성 조건으로는 모든 프로테아제를 불활성화하기에 충분하지 않으므로, 권장 농도의 최소 2배에 해당하는 완전 프로테아제 억제제 칵테일(complete protease inhibitor cocktail)을 사용할 것을 권장합니다.

본 시연에서는 특정 표적 단백질이 과발현된 효모 세포의 용해물을 사용하겠습니다. 일반적으로 VWR에서 구입 가능한 96-웰 블록에서 2 mL의 배양액으로 하룻밤 동안 배양하지만, 발현량이 적은 단백질을 분석할 때는 더 많은 양의 배양액을 사용해야 합니다.

배양액을 상온에서 2000 RCF로 5분간 원심분리하여 세포를 수확합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, 세포를 물에 재현탁한 뒤 다시 원심분리하여 세척합니다. 두 번째 원심분리가 끝나면 상층액을 제거하고 세포를 적정량의 플레이팅 용액(plating solution)으로 재현탁합니다. 용액 내의 효소(zy)가 세포벽을 분해하여, 적은 양의 용해 버퍼(lysis buffer)만으로도 세포를 효율적으로 용해할 수 있게 됩니다. 30 °C에서 30분 동안 배양합니다.

이번에는 남은 플라스틱 세포들을 800 RCF에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. 상층액을 완전히 제거하고 각 펠릿을 100 µL의 용해 버퍼에 재현탁합니다. 그다음, 블록을 테이프로 덮고 고속으로 2분 동안 볼텍싱합니다.

이렇게 하면 4,000 RCF에서 2분 동안 원심분리하여 세포 잔해를 가라앉힐 수 있습니다. 상층액을 96-웰 PCR 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다.

일반적으로 당사 실험실에서는 한 번에 수백 개의 샘플을 분석하므로, 이를 보조하기 위해 액체 핸들링 시스템을 사용합니다. 필요한 경우, 용해물의 단백질 농도를 측정하십시오. 다음으로, 샘플에 4x 샘플 버퍼를 첨가하여 1x 샘플 버퍼가 포함된 용해물을 만든 후 실온에서 5분 동안 배양하십시오.

이제 샘플을 젤에 로딩합니다. 필요한 경우, SDS page 분석을 위해 샘플의 절반을 보관하십시오. 또한, 프리스테인 마커와 닭 flector s extract와 같은 초고분자량 마커를 포함한 분자량 마커를 로딩합니다.

필요한 경우, 저분자량 단백질의 확산을 방지하기 위해 젤을 차갑게 유지하는 것이 중요하므로 저온실에서 진행하는 것이 좋습니다. 젤 길이 1cm당 3V 미만의 낮은 전압으로 젤을 전기영동하십시오. 염료가 젤 끝에서 약 1cm 거리까지 도달할 때까지 수 시간 동안 전기영동을 수행하십시오.

아밀로이드는 상온의 2% SDS에 의해 변성되지 않으므로, 대부분의 비아밀로이드 응집체를 포함한 다른 복합체들이 2% SDS 존재 하에 해리되는 동안 아밀로이드는 온전한 상태로 유지됩니다. 따라서 대부분의 단백질은 단량체 상태가 되어 젤을 빠르게 통과하는 반면, SDS에 내성이 있는 고분자량 아밀로이드는 더 느리게 이동하게 됩니다.

이후 겔은 전이 준비가 완료됩니다. 여러 가지 전이 방법을 사용할 수 있지만, 모세관 전이(capillary transfer)를 사용할 때 가장 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 모세관 전이는 어떤 크기의 겔도 수용할 수 있으므로, 수백 개의 샘플을 분석하는 데 실용적입니다.

건조된 블로팅 페이퍼 적층체는 버퍼를 젤 사이로 끌어당겨, 페이퍼와 젤 사이에 배치된 니트로셀룰로오스 막에 단백질을 전사시키는 역할을 합니다. gel과 동일한 크기로 high bond C, extra와 같은 니트로셀룰로오스를 절단하여 준비하십시오. 또한 gel과 동일한 크기로 GBO 04 블로팅 페이퍼 20장과 GBO 02 블로팅 페이퍼 8장을 절단하여 준비하십시오.

GB04는 매우 두껍고 흡수력이 좋습니다. 반면 GB02는 훨씬 더 얇고 질감이 섬세하여 멤브레인과 더 고르게 접촉할 수 있습니다. 심지로 사용할 GB04 조각을 추가로 자르되, 겔이 담긴 너비보다 약 20 cm 더 넓게 준비하십시오.

플라스틱 용기에 nitrous UL WIC, GBO 02 4장, XTBS 1장을 준비하고, 다음과 같이 거름종이 층을 쌓습니다. 먼저 건조된 GBO 04 20장을 쌓습니다. 그다음 건조된 GBO 02 4장을 쌓습니다. 마지막으로 미리 적신 GBO 02 1장을 쌓습니다.

이 적층물 위에 니트로셀룰로오스를 올립니다. 캐스팅 트레이 위의 겔을 물로 짧게 헹궈 과잉의 러닝 버퍼를 제거합니다. 그런 다음, 필요에 따라 TBS를 뿌려 멤브레인을 적시면서, 겔을 트레이에서 적층물 위로 조심스럽게 밀어 옮기기 시작합니다.

추가 버퍼는 기포가 겔 내부에 갇히는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 겔을 스택으로 완전히 옮긴 후에는 전이 피펫을 사용하면 이 작업에 효과적입니다. 기포가 있는지 철저히 확인하십시오.

겔의 가장자리를 들어 올리고 기포가 제거될 때까지 버퍼를 다시 도포합니다. 미리 적신 나머지 3개의 GBO oh two 조각을 겔 위에 올립니다. 스택의 상단을 피펫으로 단단히 밀어 굴려 모든 층이 완전히 밀착되도록 합니다.

TBS가 담긴 두 개의 높은 트레이로 전사 스택의 양옆을 받치고, 심지(wick)의 양 끝이 트레이에 잠기도록 미리 적신 심지를 스택 위에 걸쳐 놓습니다. TBS 내에서 조립된 전사 스택 위를 500 mL 생수병과 같이 무게감이 있는 추가 플라스틱 트레이로 덮어줍니다. 심지가 트레이에서 완충액을 끌어오면, 건조한 블로팅 페이퍼가 몇 시간에 걸쳐 겔을 통해 완충액을 끌어당기게 됩니다.

이렇게 하면 단백질이 막에 침전되며, 전이 과정이 최소 3시간 또는 밤새 진행되도록 합니다. 모세관 전이가 완료되면, 막을 표준 웨스턴 블로팅법으로 처리할 수 있습니다. 여기 보시는 것은 특정 단백질이 아밀로이드를 형성하도록 유도하는 효모 균주에서 과발현된 단백질의 전형적인 블롯 결과입니다.

여기 그리고 여기에 표시된 것과 같이, 일부 후보 물질들은 아밀로이드 또는 고분자량의 SDS 내성 종을 매우 잘 형성하는 것을 명확히 확인할 수 있습니다. 반면, 이들과 이들처럼 응집체를 형성하지 않고 완전히 단량체 상태로 존재하는 것들도 있습니다. 또한, 이 두 레인에서 볼 수 있듯이 단백질에 따라 아밀로이드 중합체의 크기가 서로 다르다는 것을 알 수 있습니다.

지금까지 후보 프리온의 아밀로이드와 같이 고분자량의 불용성 응집체를 분석하는 간단한 방법을 보여드렸습니다. 저희의 발표가 유익하셨기를 바라며, 이 기술이 아밀로이드 면역원성 단백질 연구에 도움이 되기를 바랍니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 연구에 좋은 결과가 있기를 기원합니다.