Methylated DNA의 Immunoprecipitation

이 영상에서는 메틸화된 DNA 면역침강법(methylated DNA immunoprecipitation) 또는 meetup 프로토콜을 설명합니다. 이는 편향되지 않은 방식으로 메틸화된 DNA를 특이적으로 분리하는 데 사용되는 방법입니다. 포유류의 DNA 메틸화는 시토신의 C5 위치에 메틸기가 추가되는 것이 특징입니다.

CPG 디뉴클레오타이드에 존재할 때, 이는 정상적인 발달뿐만 아니라 여러 질병 과정에서 중요한 역할을 하는 가역적인 후성유전학적 표지가 됩니다. DNA 메틸화의 정상적인 기능에는 여성의 X 염색체 불활성화, 반복 서열의 소멸, 게놈 각인 및 게놈 안정성 유지가 포함됩니다. 또한 DNA 메틸화는 암, 드윌리 증후군, 엔겔만 증후군, 면역결핍 중심절 불안정성 및 안면 기형 증후군과 같은 수많은 질병에서 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다.

예를 들어, 암에서는 비정상적인 과메틸화와 프로모터로 인해 필수적인 종양 억제 유전자의 발현이 억제될 수 있습니다. 부적절한 저메틸화는 염색체 불안정성과 온코진 활성화를 초래하며, 분석은 먼저 DNA를 300에서 1000 base pairs 크기의 조각으로 초음파 분쇄하여 수행합니다. 그 후 초음파 분쇄된 DNA를 95 °C에서 변성시킵니다.

5-메틸사이토신을 인식하는 1차 항체를 첨가하여 메틸화된 DNA 단편에 결합하도록 합니다. 마그네틱 다이나비드(magnetic dyna beads)가 접합된 2차 항체를 사용하여 1차 항체가 결합한 DNA 단편을 분리합니다. 메틸화되지 않은 단편은 제거하고, 항체는 단백질 분해 효소(proteinase)로 소화시킵니다.

KA 페닐 클로로폼 정제 과정을 통해 소화된 단백질을 제거하고, 침전을 통해 DNA를 정제하면 메틸화된 단편이 농축됩니다. 정제된 DNA는 PCR 마이크로어레이 및 시퀀싱과 같은 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 정제 과정은 일반적으로 2일에 걸쳐 수행됩니다.

첫째 날에는 DNA 준비, 초음파 처리 면역침전 및 단백질 소화 단계가 진행됩니다. 둘째 날에는 메틸화가 농축된 DNA를 정제하고 분리하기 위해 pH 클로로포름 추출과 에탄올 침전 단계를 수행합니다. 실리콘 처리된 원심분리 튜브, DNA 초음파 처리 장치, 1차 항체(anti 5-methylcytosine mouse monoclonal antibody), 2차 항체(sheep anti-mouse IgG가 접합된 Dynabeads), 그리고 자석 튜브 랙을 포함하여 준비가 필요한 몇 가지 특수 재료가 있습니다.

Meetup 프로토콜의 첫 번째 단계는 DNA 준비입니다. 사전에 DNA의 성질을 평가하는 것이 필수적입니다. 샘플의 정확한 정량이 매우 중요하며, 원치 않는 DNA 종의 존재로 인해 DNA 양을 결정하는 다양한 방법들이 부정적인 영향을 받을 수 있으므로, 샘플 DNA가 주로 이중 가닥인지 또는 단일 가닥인지 그 상태를 파악해야 합니다.

이중 가닥 DNA 양은 NanoDrop 3,000을 이용한 분광 광도법으로 쉽게 측정할 수 있습니다. 1.5 µL를 로딩하고 측정 유형을 핵산으로 설정한 후, 계산 방식을 DNA 50으로 선택하고 1.5 µL의 물로 기기를 초기화합니다. 페데스탈을 세척하고 1.5 µL의 액체로 기기의 바탕값을 측정합니다. 샘플이 용해되면 페데스탈을 세척하고 샘플 1.5 µL를 로딩한 후 측정 버튼을 누릅니다.

농도가 제공되며 이를 사용할 수 있습니다. 필요한 마이크로리터 수를 계산하려면, 여기서는 1.8의 A260 대 A280 비율이 이상적입니다. 1 µg 샘플을 준비합니다.

하지만 200 nanograms 정도의 적은 양의 샘플로도 성공적인 결과를 얻기에 충분합니다. 준비 단계로, 깨끗한 실리콘 처리 튜브에 DNA 샘플을 넣으십시오. 최종 부피가 50 microliters가 되도록 멸균수를 충분히 첨가하십시오.

DNA와 단백질이 튜브 벽에 비특이적으로 결합하는 것을 방지하기 위해 DNA 소니케이션 및 면역침강은 반드시 실리콘 코팅된 튜브에서 수행해야 합니다. DNA 준비가 완료되면 샘플을 소니케이션해야 합니다. 면역침강은 DNA 단편의 크기가 작을수록 더 효율적이므로 소니케이션을 통해 DNA를 단편화해야 합니다. 샘플을 소니케이터에 넣고 전원 설정이 'high'로 되어 있는지, 기기 설정이 30초 작동, 30초 휴지로 설정되어 있는지 확인하십시오. 하단 수조의 표시선까지 4 °C의 물을 채우십시오.

샘플을 7분 동안 초음파 처리하십시오. 초음파 처리가 완료되면 튜브를 꺼내 얼음에 박으십시오. 예상되는 샘플의 DNA 크기에 맞추어 초음파 처리 조건을 사전에 최적화하는 것이 중요합니다.

예를 들어, 부분적으로 분해된 DNA 샘플의 경우 초음파 처리 시간을 더 짧게 설정해야 합니다. 초음파 처리 결과물은 표준 전기영동 기법으로 시각화할 수 있습니다. 이후 단계에서 사용하기 위해, 이 시점에서는 길이가 300에서 1000 base pairs 범위인 DNA 단편이 필요합니다.

마이크로어레이 및 PCR 분석에서는 DNA의 5분의 1을 투입 DNA 또는 대조 DNA로 남겨두어야 하며, 이 경우 초음파 처리된 DNA 800 nanograms를 면역침전물에 사용하고 나머지는 대조 DNA로 따로 보관합니다. 미디어 프로토콜의 다음 단계는 면역침전 또는 IP 반응으로, 1차 항체를 첨가하기 전에 DNA를 변성시켜야 합니다. 1차 항체는 단일 가닥 DNA에 민감하기 때문에 변성 과정이 필요합니다.

샘플을 95 °C의 항온수조에 10분 동안 둡니다. 변성 단계가 완료되면 즉시 튜브를 얼음에 옮겨 최소 5분 동안 유지합니다. 이렇게 하면 변성된 DNA의 재결합을 방지하여 샘플이 냉각되었을 때 항체가 최적으로 결합할 수 있게 됩니다.

튜브를 짧게 원심 분리하여 내용물을 바닥으로 모읍니다. 다음으로, 1차 항체를 첨가합니다. 사용되는 항체의 양은 각 배치 및 제조사별로 적정(titration)하여 결정해야 합니다.

이 사례에서는 5 µg의 1차 항체를 첨가한 후, 면역침강 완충액(immunoprecipitation buffer 또는 IP buffer)을 넣어 최종 부피를 500 µL로 맞춥니다. 다음으로, IP DNA를 로테이터(rotator)에 넣고 4 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 중 튜브 내에서 항체가 뭉치는 것을 방지하기 위해 회전이 필요합니다.

1차 항체 반응이 완료되기 약 15분 전에 마그네틱 다이나 비드(magnetic dyna beads)를 세척하고 준비합니다. 먼저, 보텍싱(vortexing)을 통해 바이알 내의 비드를 완전히 재현탁합니다. 그다음, 비드 30 µL를 깨끗한 실리콘 처리 튜브에 옮기고, 해당 튜브를 다중 반응용 마그네틱 랙에 놓습니다.

반응당 30 microliters의 비드를 분주하되, 피펫팅 오차나 비드의 의도치 않은 손실을 고려하여 1회분 추가량을 준비하십시오. 예를 들어, 8회 반응의 경우 9회분에 해당하는 비드 또는 270 microliters를 취하십시오.

마그네틱 비드는 마그네틱 랙의 벽면 쪽으로 끌려가게 됩니다. 비드가 이동하여 튜브 벽면에 일정한 선 형태로 가라앉을 때까지 2분 동안 기다립니다. 다음으로, 피펫 팁으로 뒷벽의 비드를 건드리지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 제거하여 버립니다.

상층액을 과량의 IP buffer로 교체한 후 vortexing하고, 다시 자성 랙에 2분 동안 둡니다. 이 세척 과정을 한 번 더 반복하고, 세척된 비드를 원래 부피의 IP buffer에 재현탁합니다. 배양이 끝나면 Rotator에서 샘플 튜브를 꺼냅니다.

면역침전법을 완료하려면, 30 µL의 깨끗한 비드를 반응액에 첨가하고 튜브를 다시 회전 장치에 넣어 4 °C에서 2시간 동안 반응시킵니다. 이 배양 과정 동안 anti-mouse IgG인 2차 항체가 1차 마우스 항체에 결합합니다. anti-mouse 항체는 마그네틱 DynaBeads에 접합되어 있어, 결합된 생성물을 쉽게 회수하고 이어지는 정제 단계를 수행할 수 있습니다.

두 항체 모두를 이용한 배양이 완료되면, IP 튜브를 마그네틱 랙에 2분 동안 둡니다. 이 시점에서 메틸화된 DNA는 1차 항체에 결합되어 있으며, 1차 항체는 다시 dyna bead가 결합된 2차 항체와 결합된 상태가 됩니다. 상층액을 제거하여 버리고 500 µL의 IP 버퍼로 교체합니다.

튜브의 내용물을 혼합하고 랙에 다시 2분 동안 둡니다. 이 세척 과정을 IP 버퍼로 한 번 더 반복합니다. 마지막 세척 후 상층액을 제거하고, 비드를 최종적으로 현탁합니다.

400 µL의 소화 완충액(digestion Buffer)에 100 µg의 proteinase K를 넣어 반응시키고 50 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. proteinase K 처리는 항체 단백질과 DNA에 결합된 잔류 단백질을 소화하여 메틸화된 DNA가 용액 속으로 방출되도록 하는 데 필요합니다. DNA 정제는 실험 절차의 둘째 날에 수행하며, 배양기에서 소화된 튜브를 꺼냅니다.

흄 후드 내에서 pH 7의 1:1 페놀-클로로포름 500 µL를 튜브에 넣고 충분히 볼텍싱합니다. 튜브를 13,000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 계면을 흐트러뜨리거나 유기층을 제거하지 않도록 주의하며 튜브 상층의 수층을 조심스럽게 제거합니다. 제거한 수층을 새 튜브로 옮깁니다.

계면이 흐릿하게 보일 경우 2차 추출을 수행할 수 있습니다. 다음으로, 3 M sodium acetate를 전체 부피의 10분의 1만큼, 이 경우에는 40 µL 첨가합니다. 펠렛 회수 효율을 높이기 위한 운반체로 1 µL의 glycogen을 사용할 수 있습니다.

튜브를 볼텍싱하여 내용물을 혼합합니다. 그런 다음 100% ethanol을 2배 부피로 첨가하고, 볼텍싱한 후 -20 °C 냉동고에서 20분 동안 냉동합니다. 냉동 후, 침전된 DNA를 13,000 G, 4 °C 조건의 원심분리기로 20분 동안 원심분리하여 가라앉힙니다.

튜브 바닥에 DNA 펠릿이 형성됩니다. 원심분리기에서 튜브를 꺼내 에탄올을 제거하십시오. 이때 튜브 바닥의 펠릿이 손상되지 않도록 주의하십시오.

잔류 에탄올을 제거하기 위해 펄스 스핀(pulse spin)이 필요할 수 있습니다. 펠릿을 세척하려면 차가운 70% ethanol 500 microliters를 첨가하여 볼텍싱(vortex)하고, 4°C에서 13,000 G로 20분 동안 다시 원심분리하십시오. 두 번째 원심분리가 완료되면 70% ethanol 펄스 스핀을 수행하고 파이펫으로 잔류 에탄올을 제거하십시오.

펠렛을 건조시키고 남아있는 에탄올을 증발시키기 위해 튜브 캡을 연 상태로 랙에 둡니다. 마지막으로, 메틸화가 농축된 DNA만 포함된 펠렛에 10 µL의 멸균수를 넣어 재현탁하며, 사용 전 DNA 펠렛이 충분히 용해될 수 있도록 시간을 둡니다. PCR을 통해 회수 효율을 검증하는 것이 권장됩니다.

이는 정상 인간 DNA 프라이머를 사용하여 메틸화된 DNA 단편과 비메틸화된 DNA 단편을 차등적으로 보여주는 생성물을 증폭하도록 설계된 PCR 반응을 수행함으로써 가능합니다. H 19 각인 조절 영역은 메틸화되지 않은 게놈 영역을 증폭하도록 설계된 프라이머와 함께 사용할 수 있습니다. 예시 프라이머 서열 및 PCR 사이클 조건은 첨부된 프로토콜에서 확인할 수 있습니다.

이 시점에서, 미팅 프로토콜(meetup protocol) 시작 시 따로 보관해 두었던 입력 DNA 또는 대조 DNA를 회수해야 합니다. 한 세트의 PCR 반응은 입력 DNA를 사용하여 설정하고, 다른 세트는 메틸화가 농축된 IP DNA를 사용하여 설정합니다. 미팅이 성공적이었다면, IP PCR은 메틸화 프라이머를 사용했을 때만 산물을 생성하고 대조 프라이머를 사용했을 때는 산물을 생성하지 않을 것입니다.

반대로, 입력 PCR은 메틸화된 DNA 단편과 비메틸화된 DNA 단편을 모두 포함하고 있으므로 두 프라이머를 모두 사용하여 생성물을 만들어내야 합니다. 메틸화된 단편이 농축된 DNA는 PCR 시퀀싱 및 마이크로어레이 분석과 같은 다양한 다운스트림 응용 분야에 사용될 수 있습니다.

다른 분자 생물학적 기법과 통합하여 사용하면, 메틸화 프로파일링 또는 후성유전학 연구를 위해 특정 유전자좌 또는 게놈 전체 범위에서 DNA의 메틸화 상태를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.