CyDye DIGE 플루어 최소 염료를 사용하여 셀 표면 단백질의 선택적 Labelling

제 이름은 Maria이며, 스웨덴 NOS의 Y Healthcare에서 근무하고 있습니다. 세포 표면 단백질은 종종 세포와 주변 환경 사이의 통신에 관여하므로, 세포 환경 변화로 인해 유도되는 기타 생물학적 변이뿐만 아니라 질병에 대한 더 많은 통찰력을 얻고자 하는 연구에서 특히 중요하게 다뤄집니다. 이 영상에서는 간단한 side-eye dodge 세포 표면 표지 프로토콜을 보여드릴 것이며, 여러분은 물리적 증폭 없이도 이러한 저발현 단백질을 시각적으로 농축하고 이 기술을 통해 세포 표면 단백질의 차이점을 연구할 수 있게 될 것입니다.

이 기술에 관심이 있으시다면 2D 핸드북에서 더 많은 정보를 확인하실 수 있습니다. 또한, 이 특정 주제에 관한 애플리케이션 노트를 job에서 다운로드하실 수 있습니다. 위에 제시된 세포 표면 표지 프로토콜에서는 세포가 온전한 상태일 때 표지를 수행합니다. 표지 과정 동안 염료는 세포 표면 단백질에만 접근할 수 있습니다.

표지 단계 후, 세포 표면 특이적 표지가 이루어졌는지 확인하기 위해 세포를 분석합니다. 표지된 시료를 막 단백질과 세포질 단백질로 분획하였습니다. 이와 병행하여 분획하지 않은 시료도 함께 준비하였습니다.

비교를 위해 이 분획 분석은 필수적이지는 않지만, 여기서는 세포 표면 프로토콜이 세포 표면 단백질에 특이적이라는 것을 보여주기 위해 수행되었습니다. 또한 아래에 제시된 표준 ETH 비식단 표지 프로토콜을 수행하였으며, 이 방식에서는 표지 전 세포가 용해되어 모든 세포 단백질이 표지 가능 상태가 됩니다. 표지 단계 이후, 샘플은 2차원 전기영동 분석을 거칩니다.

표적 세포 표면 단백질의 소화를 방지하기 위해 비효소적 절차를 사용하여 부착 세포를 분리합니다. 본 프로토콜에서는 고무 폴리스맨(rubber policeman)을 사용하지만, enzyme-free 세포 해리 배지를 사용하는 것도 가능합니다. 세포 현탁액의 수를 측정하고 튜브당 500만에서 1,000만 개의 세포가 되도록 나누어 담습니다. 그 후 세포를 원심 분리하여 펠렛으로 만들고 H-P-S-S-P-H 7.4로 세척하여 세포 배양액의 잔해를 제거합니다.

혈청 단백질과 형광 성분으로 인한 배지 오염은 표지 및 검출을 방해할 수 있습니다. 부유 배양된 세포는 표지 단계 이전 세척 후 직접 펠렛화하여 세척합니다. 세포 펠렛은 HPSS pH 8.5와 1 M urea가 포함된 200 µL의 ice cold 표지 버퍼에 재현탁합니다.

세포 표면 단백질의 최적의 라벨링 조건을 위해 항상 pH를 확인하십시오. 라벨링 전, 1,000만 개의 CHO 세포에 대해 600 pmol의 side-eye를 사용하였습니다. side-eye와 세포 수의 최적 비율은 세포 유형에 따라 달라질 수 있습니다.

세포 표면의 정확한 단백질 농도를 알 수 없으므로, 단백질의 side-eye 라벨링을 위한 최적 조건을 결정하는 방법은 2D 전기영동 원리 및 방법 핸드북에 설명되어 있습니다. 세포를 side eye D floor, minimal dice와 함께 얼음 위 암실에서 20분 동안 배양합니다.

표지 반응 후, 10 millimolar 라이신 20 µL를 첨가하여 반응하지 않은 염료를 퀜칭합니다. 표지된 세포를 차가운 HPSS pH 7.4 완충액으로 두 번 세척하여 과잉 염료를 제거합니다. 이렇게 하면 다음 단계인 세포 용해 과정에서 원치 않는 세포 내 표지나 단백질 표지가 일어날 수 있는 유리 염료가 남지 않게 됩니다.

이제 세포 표면의 단백질이 표지되었으며, 세포를 세척하여 용해할 준비가 되었습니다. 마지막 세척 단계에서 얻은 펠릿을 7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 30 mM Tris, 5 mM magnesium acetate (pH 8.5)가 포함된 150 µL의 차가운 용해 버퍼에 재현탁하고, 가끔씩 볼텍싱하며 얼음 위에서 최소 1시간 동안 방치합니다. 이제 샘플은 2차원 분리를 수행할 준비가 되었습니다.

전기영동의 첫 번째 단계는 재수화(rehydration)를 위해 IPG 스트립을 준비하는 것입니다. 사용하는 스트립의 pH 범위에 맞는 IPG 완충액을 추가하여 재수화 용액을 제조하고, 이 용액을 재수화 트레이의 렌즈 부분에 넣습니다. IPG 스트립의 보호 필름을 제거하고, 건조된 겔 면이 재수화 용액이 담긴 재수화 트레이를 향하도록 스트립을 조심스럽게 배치합니다.

IPG 박스의 뚜껑을 닫고 스트립을 하룻밤 동안 재수화합니다. 1차원 분리인 등전점 전기영동(isoelectric focusing)에서 단백질은 각각의 pI 값에 따라 분리됩니다. 이 과정은 IPG four three를 사용하여 수행합니다.

재수화된 스트립을 매니폴드에 배치하고 상단에 전극을 장착합니다. 샘플 적용 캡을 사용하여 각 샘플에서 50 micrograms를 도포합니다. 사전 분획을 거치지 않은 비분획 샘플을 직접 도포하거나, 도포 전 샘플을 막 분획과 세포질 분획으로 분획하였습니다.

형광 샘플을 빛으로부터 보호하기 위해 리드를 닫습니다. 장비는 권장 사항에 따라 프로그래밍되었으며 밤새 가동되었습니다. 성체 12 젤을 사용하여 대형 12% lamby 젤을 제작했습니다.

튜빙 내에서 아크릴아마이드 겔의 중합을 방지하기 위해 Coster 치환 용액을 첨가하였습니다. 겔은 사용 전 실온에서 하룻밤 동안 중합되도록 두었습니다. 등전점 전기영동 후, 스트립을 제거하고 SDS 함유 완충액에서 두 단계에 걸쳐 평형화합니다. 먼저 DTT를 사용하여 시스테인 잔기의 이황화 결합을 환원시킨 후, 아크릴아마이드에 의한 수정을 방지하기 위해 iodoacetamide로 알킬화합니다.

IPG 스트립을 러닝 버퍼에 담근 후, 두 개의 큰 2차원 겔 상단에 조심스럽게 배치합니다. 스트립과 겔 사이에 공기가 갇히지 않도록 브로모페놀 블루(bromo phenol blue)가 포함된 녹인 2% agarose 용액을 상단에 추가하여 밀봉합니다. 이제 겔은 2차원 SDS-PAGE 분리 준비가 완료되었습니다. 2차원 SDS-PAGE 과정에서는

단백질은 분자량에 따라 분리되며, 이는 tonal six 시스템을 사용하여 수행합니다. 전기영동 챔버에 양극 러닝 버퍼를 채우고, 젤을 삽입한 후 상단 구획에 음극 러닝 버퍼를 채웁니다. 권장 사항에 따라 전원 공급 장치를 설정하고, 빛이 차단된 상태에서 2차원 전기영동을 약 4~5시간 동안 또는 염료 전선이 젤 하단에 도달할 때까지 실행합니다.

2차원 전기영동 후, 그리퍼를 사용하여 젤 카세트를 Typhoon 형광 이미지 분석기에 배치합니다. 두 개의 젤과 세 개의 채널을 동시에 스캔할 수 있습니다. 이 2차원-DL(two DL)의 결과는 소수성 단백질이 2차원-DL에서 검출되는 데 일부 알려진 제약이 있음에도 불구하고, 시료 내 막 단백질의 높은 해상도를 보여줍니다. 결과에서는 표준 라벨링 프로토콜(초록색으로 표시)을 사용했을 때는 검출되지 않았으나, 여기에서는 빨간색으로 표시된 많은 새로운 세포 표면 라벨 스팟들이 나타납니다.

이 결과는 세포 표면 표지 프로토콜이 세포 표면 단백질을 표지하는 데 매우 특이적임을 보여줍니다. 세포 표면 단백질만 선택적으로 표지되므로, 이들을 더 쉽게 시각화할 수 있으며 풍부한 세포질 단백질에 의한 감쇄를 방지할 수 있습니다. 분획하지 않은 막 분획물 또는 세포질 분획물이 포함된 겔의 형광 이미지는 상단에 표시되어 있습니다.

아래는 은(silver)으로 염색한 동일한 젤의 이미지입니다. 결과에서 세포질 단백질의 형광 표지는 나타나지 않았으나, 은 염색을 통해 젤 내에 단백질이 존재함이 확인되었습니다. 또한, 분획되지 않은 시료와 막 분획물에서 유사한 스팟 맵 패턴이 관찰되었으며, 이는 2차원 전기영동 전 분획 과정이 필요하지 않음을 보여줍니다. 따라서 본 프로토콜은 단순하고 편리합니다.

SI two, SI three 및 SCI five는 유사한 표지 패턴을 보이며 모두 세포 표면 프로토콜과 호환됩니다. 혈청 기아 상태의 기간에 따른 CHO 세포 내 세포 표면 단백질의 차등 발현을 연구하기 위해 세 가지 side eye DI floor minimal dy를 모두 사용하여 식이 실험을 수행하였습니다. 실험의 모든 샘플에서 얻은 CY two 세포 표면 샘플을 풀링(pooling)하여 내부 표준 물질로 사용하였습니다.

기아 기간 동안 여러 세포 표면 단백질의 차등적인 변화를 추적할 수 있었습니다. 세포 표면 프로토콜을 사용하여, 분취 젤(preparative gel)에서 단백질의 정체를 확인하기 위한 표준 프로토콜로는 검출되지 않았던 18개 이상의 새로운 막 단백질을 검출하였습니다. 분석 데이터 세트의 스팟과 다시 매칭하는 것을 용이하게 하기 위해 세포 표면 샘플을 스파이크(spike)하는 과정이 필요했습니다.

결과입니다. 결과에서는 다수의 세포 표면 단백질이 고해상도로 나타남을 보여줍니다. 이 프로토콜은 세포 표면 단백질에 매우 특이적이며, 세포 내 단백질의 표지는 관찰되지 않았습니다.

이 방법을 통해 표준 프로토콜과 비교하여 더 많은 세포 표면 단백질을 검출할 수 있으며, 이미 확인하신 것처럼 매우 간단하게 수행할 수 있는 프로토콜입니다. 세포 표면 단백질이 온전한 상태일 때 그대로 라벨링한 후, 막 분획 과정 없이 즉시 2D 전기영동을 실시하면 됩니다. 따라서 이 프로토콜은 세포 표면 단백질과 D 기술을 이용한 단백질 간의 차이를 연구하는 데 매우 유용합니다.