칙의 전체 마운트 항체 스테 이닝을위한 방법

이 영상에서는 HRP 접합 2차 항체를 이용한 병아리 배아의 전체 마운트 면역조직화학 염색의 다양한 단계들을 보여줍니다. 먼저, 배아를 파라포름알데히드로 고정합니다. 그 후 내인성 퍼옥시다제 활성을 억제합니다.

그 후 배아를 1차 항체에서 배양합니다. 여러 번 세척한 뒤, 배아를 HRP가 결합된 2차 항체에서 배양합니다. DAB 기질을 사용하여 발색 반응을 나타내면 항체 염색 부위가 주황색으로 나타납니다. 형광 항체를 사용하는 것보다 이 방법이 가진 장점은 배아를 파라핀 섹셔닝 공정으로 처리할 수 있어, 항원 부위를 횡단면으로 연구할 수 있다는 점입니다.

안녕하세요, 저는 텍사스 A&M 대학교 휴스턴 캠퍼스 환경 및 게놈 의학 센터 FIN 연구실의 Delphine입니다. 오늘은 HRP 접합 항체를 사용하여 닭 배아에서 호르몬 마운트 항체 염색을 수행하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 항경련제 처리 후 배아의 형태학적 변화를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

그럼 병아리 배아의 전장 면역조직화학염색(whole mount immunohistochemistry)을 수행해 보겠습니다. 먼저 핀셋으로 껍질을 톡톡 두드려 깨뜨린 후 껍질 조각들을 제거하여 알을 엽니다. 핀셋으로 두꺼운 알부민을 제거하고, 거친 핀셋으로 난황낭을 기울여 배아가 위를 향하게 합니다.

다음으로 미세 가위를 사용하여 배아 주변의 난황낭을 정사각형 모양으로 절단합니다. 숟가락을 이용해 난황에서 배아를 분리한 후, 해부 현미경 하에서 PBS가 담긴 접시에 놓습니다. 난황에 붙은 막을 조심스럽게 제거하고 배아를 PBS가 담긴 새 접시로 옮깁니다.

배아를 옮긴 후, 포셉과 곤충 핀으로 배아를 고정하고 PBS를 흡입하여 제거합니다. 이를 4% PFA in PBS로 교체하고, 잠재적인 미생물 오염을 최소화하기 위해 실온에서 1시간 동안 배아를 고정합니다. 배아가 고정된 이후의 모든 단계에서는 탈이온수(deionized H2O)를 사용하며, 고정액은 흡입하여 화학 폐기물로 적절히 처리합니다.

접시에 BS를 채웁니다. 다음으로, 미세해부도를 사용하여 배아 주변을 사각형으로 절개하여 여분의 배아막을 제거합니다. 핀을 제거한 후 핀셋으로 곤충 핀을 제거합니다. 끝이 뭉툭한 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아를 PBT가 들어 있는 신틸레이션 바이알로 옮깁니다.

배아를 PBT로 10분씩 3회 세척합니다. 신틸레이션 바이알에서 PBT를 제거하고, 잠재적인 내인성 peroxidase를 비활성화하기 위해 0.3%H 2 0 2가 포함된 PBTX로 교체합니다. 흔들개(mutator)를 사용하여 상온에서 2시간 동안 배양합니다.

먼저 배아를 PBT로 10분씩 3회 세척한 다음, 30분씩 3회 세척합니다. 항체로 배아를 염색하기 위해, 블로킹 버퍼 또는 1%BSA 1%NGS에서 1시간 동안 배아를 세척하며 시작합니다.

2차 항체가 염소에서 생성되었으므로 NGS를 사용합니다. 배양 후 셰이커(mutator)에서 실온으로 1시간 동안 반응시킵니다. 1차 항체를 블로킹 버퍼와 1:1 비율로 희석한 후, 배아를 이 용액에 넣어 4°C에서 2일 동안 배양합니다. 셰이커(mutator)를 사용하십시오.

1차 항체 희석 배수는 선택한 1차 항체에 따라 달라집니다. 여기서는 상층액 형태로 제공되는 developmental studies hybrid DOMA 뱅크의 항체를 사용합니다. 이를 블로킹 완충액으로 1:1 비율로 희석합니다.

다음으로, PBT에서 10분씩 3회 세척한 후, 다시 PBT에서 1시간씩 3회 세척합니다. 세척 후, 2차 항체를 블로킹 버퍼에 1:2,500 비율로 희석합니다. 본 실험에서는 peroxidase가 접합된 goat anti-US IgG를 사용하며, 배아를 이 용액에 넣어 4°C에서 하룻밤 동안 진탕기(mutator)로 인큐베이션합니다.

염색된 배아의 발색 반응을 유도하기 위해 PBT로 10분씩 3회 세척한 후, 이어서 PBT로 1시간씩 3회 세척합니다. 처음에는 100 millimolar tris, HCL pH 7.4 tris 버퍼로 20분씩 2회 세척합니다. 다음으로, 배아가 들어 있는 바이알에서 마지막 TS 버퍼 세척액을 제거하고 5 mL의 DAB 용액으로 교체합니다.

뮤테이터(mutator)에서 20분 동안 암소 보관하십시오. 사용한 팁은 10% 표백액이 담긴 버킷에 폐기하십시오. DAB를 오염 제거하기 위해 16 µL를 추가하십시오.

배아들이 들어 있는 DAB 바이알에 H₂O₂ 스톡 용액을 첨가합니다. 암실 상태로 유지하십시오. 10분 후, 현미경으로 반응을 관찰하여 발색 반응이 완료되었는지 확인합니다. 사용한 DAB는 표백제 버킷에 폐기하고, 5 mL로 교체하십시오.

수돗물로 헹굽니다. 다음으로, 사진 촬영 및 파라핀 섹션을 위해 PBS로 10분씩 두 번 세척합니다. 염색된 배아를 25%, 50%, 75%, 100% 에탄올 시리즈로 각각 10분 동안 탈수합니다.

탈수 후, 에탄올을 0.5에서 1 mL의 시더우드 오일(cedarwood oil)로 교체합니다. 이렇게 하면 배아가 투명해져 시더우드 오일 내에서 촬영이 가능해집니다. 촬영 후에는 배아를 다시 바이알에 넣고 시더우드 오일을 100% 에탄올로 교체합니다.

마지막으로, 에탄올을 100% ethanol에 희석한 5% fast green FCF로 교체하고 3분 동안 배양합니다. 이 단계는 조직학적 분석을 위해 배아를 시각화하는 과정입니다. fast green FCF 용액을 100% ethanol로 교체하고 조직학적 처리를 진행합니다.

염색된 배아의 세 가지 예시입니다. 이 11단계 배아들은 15.3 B nine 또는 nodal cord 특이적 항체로 표지되었습니다. 이 항체는 Jane dod와 Tom Gessel의 실험실에서 개발되었습니다.

DAB 처리 2분 후에도 배아는 여전히 투명한 상태입니다. 20분 후에는 결절삭(nodal cord)에서 약한 표지가 나타납니다. 최종적으로 40분 후가 되면 결절삭의 표지가 완료됩니다.

본 예제에서는 Tom Jessel 연구실에서 개발한 항체인 PAC seven이 신경관 폐쇄의 초기 단계와 중뇌에서 유래하는 두개 신경능 세포를 어떻게 인식하는지 보여줍니다. 여기에서 배아는 David Wilkinson 연구실의 Croc 20 프로브로 표지한 후, 하나의 항체를 사용하여 염색하였습니다. 지금까지 닭 배아를 이용한 전장 면역조직화학 염색법을 수행하는 방법을 설명해 드렸습니다.

이 절차는 이전에 전신 내 현장 하이브리드화(whole mount in situ hybridization) 처리를 거친 배아에도 적용할 수 있습니다. 이 경우, 내 현장 하이브리드화 후 배아를 1시간 동안 짧게 고정시킨 다음 항체 염색을 진행하십시오. 이것으로 모두 끝났습니다.

시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.