Cisterna 마그나 마우스에서 뇌척수의 직렬 그룹에 대한 기술

절차는 마우스 마취와 수술 부위 준비로 시작합니다. 그 후 마우스를 뇌정위 고정 장치 위에 복와위로 배치합니다. 후두골 하단 피부를 시상 방향으로 절개하고, 정중선을 따라 피하 조직과 목 근육을 둔성 박리합니다.

그런 다음 몸의 후부를 내려 몸이 고정된 머리와 135도 각도를 이루게 하고, 유리 모세관으로 cisterna magna의 경막을 관통하여 CSF를 수집합니다. CSF 샘플링 후에는 근육을 다시 정렬하고 피부를 봉합하며, 탈수를 방지하기 위해 0.9% NaCl 식염수 약 1 mL를 피하 주사하고 마우스가 회복될 때까지 따뜻하게 유지합니다. 안녕하세요, 저는 컬럼비아 대학교 The Top Institute의 Karen Duff 박사님 실험실 소속 Liu입니다.

오늘은 마우스의 시스terna magna에서 뇌척수액을 채취하는 방법을 보여드리겠습니다. 이 기술을 통해 동일한 마우스로부터 2~3개월 간격으로 최대 3회까지 연속적인 CSF 샘플을 채집할 수 있습니다. 저희 연구실에서는 알츠하이머병 형질전환 마우스 모델의 연령별 CSF Aβ 또는 tau 수치를 측정하고, 이 값들을 뇌의 수치와 상관 분석하는 데 이 기술을 사용하고 있습니다.

마지막으로, 우리는 질병 진행 및 마우스 대상 치료 시험의 잠재적 생체 표지자로서 CSFA beta 또는 tau 수치의 가능성에 관심을 두고 있습니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 위해서는 마이크로 피펫 폴러를 사용하여 모세관을 제작해야 합니다.

여기에 사용된 모세관은 Sutter Instruments 사의 BOA silicate glass B 175 10이며, 열 지수를 300으로, 압력 지수를 330으로 설정한 Sutter P 87 flaming micro pipette puller를 사용하여 당깁니다. 유리 모세관의 길이는 5 cm이며 끝부분이 테이퍼 형태로 가늘어집니다. 모세관의 팁은 가위로 다듬어 내경이 약 0.5 mm가 되도록 합니다.

수술 절차는 케타민 100 mg/kg과 자일라진 10 mg/kg을 복강 내로 투여하여 마우스에게 마취를 실시하는 것으로 시작하며, 마취 동안에는 마우스를 37 °C 인큐베이터에서 따뜻하게 유지합니다. 발가락 꼬집기 반응(toe pinch withdrawal reflex)을 통해 동물이 완전히 마취되었음을 확인한 후, 목 부위의 털을 깎고 David Kink 사의 제품과 같은 뇌정위 고정 기구에 마우스를 배치합니다. 가열 패드와 직접 닿도록 직장 온도 프로브를 삽입하여, 마우스의 체온에 따라 패드의 온도를 조절할 수 있도록 합니다.

헤드 어댑터를 사용하여 머리를 고정하고, 목 피부를 10% povidone iodine과 70% ethanol로 3회 닦아낸 후, 머리의 후방 부위 또는 후두부 하단에 시상 절개를 가합니다. 다음 단계들은 해부 현미경 하에서 둔단 핀셋(blunt forceps)을 사용하여 수행해야 합니다. sternum magna의 경막이 노출될 때까지 subcutaneous tissue와 근육 M by ventor services 및 M rectus capita dorsalis major를 분리합니다. 마이크로 리트랙터를 적절히 사용하여 근육을 벌려 고정합니다.

마지막으로, 머리가 몸통과 135도 각도가 되도록 마우스를 눕힙니다. 이제 CSF 수집을 위한 준비가 완료되었습니다. 대조(cisterna magna)에서 CSF를 수집하는 이 기술은 이전에 발표된 바 있습니다.

해부 현미경으로 관찰한 그림 1 A입니다. 경질막은 반짝이고 투명한 역삼각형 모양으로 나타나며, 이를 통해 연수와 주요 혈관이 보입니다. 척수경질동맥, 그림 1 B. 연수와 인접한 뇌척수액(CSF) 공간의 혈행 맥동을 확인할 수 있습니다.

멸균 면봉으로 경막을 닦아 건조시킨 후, 척수背동맥의 가측 경막을 통해 대조으로 모세관을 삽입합니다. 모세관이 정확하게 삽입되면 저항의 뚜렷한 변화가 느껴지며, 이때 뇌척수액이 모세관 안으로 흐르게 됩니다. 뇌척수액 수집이 완료되면 모세관을 조심스럽게 제거하고, 내경 1 mm의 폴리에틸렌 튜브를 사용하여 3 mL 주사기에 연결합니다.

CSF를 0.5 milliliter 튜브에 분주합니다. 튜브에 라벨을 붙이고 즉시 드라이아이스에서 동결시킵니다. 동결된 후, CSF를 -80 °C 냉동고로 옮깁니다.

방금 시연한 샘플링 기술은 매우 완만하여, 동일한 마우스에서 2~3개월 간격으로 후속 CSF 샘플을 채취할 수 있습니다. 따라서 목 부위 샘플링 후에는 근육과 피부를 원래 위치로 맞추고 봉합사로 폐쇄해야 합니다. 절개 부위를 봉합한 후, 마우스의 수분을 보충하기 위해 약 1 mL의 0.9%NACL 식염수를 피하 주사하십시오.

마우스가 회복될 때까지 약 37°C로 따뜻하게 유지하십시오. 수술 후 1일째와 7일째에 체중을 측정하십시오. 지금까지 마우스의 시스템 뇌척수액(cerebral spinal fluid)을 수집하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때 기억해야 할 세 가지 중요한 사항이 있습니다. 첫째, Cy Magna의 ator가 최대한 노출될 수 있도록 정위 고정 틀(stereotactic frame) 위에 마우스의 머리와 몸통을 적절하게 배치하십시오. 둘째, 모세관으로 durometer를 관통할 때 혈관을 주의 깊게 피하십시오.

그렇지 않으면 샘플이 혈액에 의해 오염될 수 있습니다. 마지막으로, 저체온증을 방지하기 위해 전체 과정 동안 마우스의 체온을 따뜻하게 유지해야 함을 기억하십시오. 저체온증은 마우스에게 해로울 뿐만 아니라, beta 생성이나 tall hypo phosphorylation 반응을 유도하여 결과에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.