Clonaliteitsassays via Next-Generation Sequencing: Klinische Validatie voor Monitoring van Minimale Residuele Ziekte bij Multiple Myeloom

Samenvatting

Deze studie evalueerde een nieuwe op NGS gebaseerde BCR/TCR-klonaliteitsassay (OriMIRACLE LTM) voor de detectie van MRD bij lymfoïde maligniteiten, waaronder multipel myeloom (MM). Met behulp van cellijnen en klinische uitstrijkjes werd een detectiesnelheid van >90% en een concordantie van 81,36% met flowcytometrie aangetoond. De assay biedt een hoge sensitiviteit, voorspelt recidieven en ondersteunt behandelingsbeslissingen.

Samenvatting

De detectie van minimale residuele ziekte (MRD) is cruciaal voor het beheer van lymfoïde maligniteiten. Deze studie introduceert OriMIRACLE LTM, een nieuwe assay voor de clonaliteit van de B-celreceptor (BCR) en T-celreceptor (TCR) op basis van next-generation sequencing (NGS) voor MRD-detectie. We hebben de assay gevalideerd met behulp van cellijnen en klinische monsters, waaronder residuele uitstrijkjes, van patiënten met multipel myeloom (MM). De BCR/TCR-clonaliteitsassay vertoonde een positieve detectiegraad van meer dan 90% bij lymfoïde maligniteiten. Validatiestudies bij MM-patiënten toonden een concordantiegraad van 81,36% (48/59) aan tussen multicolor flowcytometrie (MFC) en de klinische beoordeling van de respons bij de detectie van tumorcellen. Opmerkelijk is dat 61,11% (11/18) van de MM-patiënten die positief waren voor MRD via zowel NGS als MFC, ziekteprogressie of een recidief vertoonden. Patiënten bij wie MRD uitsluitend via NGS werd gedetecteerd, vertoonden lagere klinische volledige responspercentages, en sommige aanvankelijk responsieve MM-patiënten kregen een recidief na stopzetting van de behandeling. Deze bevindingen geven aan dat deze NGS-gebaseerde assay een zeer gevoelige en specifieke MRD-detectie biedt bij lymfoïde maligniteiten, zelfs in residuele uitstrijkjes van MM-patiënten. Het vertoont voordelen ten opzichte van MFC en blijkt waardevol voor het volgen van MRD. Concluderend ondersteunt het huidige bewijs NGS als aanvullend instrument voor MFC, met name bij MFC⁻/NGS⁺ patiënten, aangezien NGS een diepere risicostratificatie biedt. De optimale interventiedrempel moet echter nog worden vastgesteld door prospectieve studies.

Inleiding

Multiple myeloom (MM) is een hematologische maligniteit die wordt gekenmerkt door de proliferatie van aberrante clonale plasmacellen in het beenmerg¹. In China waren er in 2022 ongeveer 22.450 nieuwe MM-diagnoses en 17.360 aan deze ziekte gerelateerde sterfgevallen². Ondanks aanzienlijke vooruitgang in de behandeling van MM gedurende het afgelopen decennium, waardoor de mediane overleving van patiënten aanzienlijk is verlengd, ervaart de meerderheid van de patiënten uiteindelijk een recidief^3,4. Deze dramatische toename onderstreept de kritieke noodzaak van nauwkeurige monitoring van de remissie, vroege voorspelling van recidieven en tijdige therapeutische interventies.

Klinisch bewijs heeft de prognostische betekenis van de status van minimale residuele ziekte (MRD) bij hematologische maligniteiten stevig vastgesteld^5,6,7. Vanwege dit belang heeft de International Myeloma Working Group (IMWG) in 2016 de MRD-beoordeling opgenomen in de criteria voor responsbeoordeling⁸. Huidige methoden voor de beoordeling van MRD in het beenmerg omvatten allele-specifieke oligonucleotide polymerasekettingreactie (ASO-PCR), digitale PCR (dPCR), multiparametrische flowcytometrie (MFC) en next-generation sequencing (NGS) assays⁸. Hoewel ASO-PCR een sensitieve detectie biedt, is het tijdrovend en moeilijk te standaardiseren vanwege de vereiste voor patiëntspecifieke primers^9,10. Op dezelfde manier wordt dPCR beperkt door het allele-specifieke ontwerp^10,11. MFC is instrumenteel geweest bij de detectie van MRD¹², waarbij snelle informatie op cellulair niveau wordt geleverd, maar het kampt met uitdagingen op het gebied van standaardisatie en reproduceerbaarheid.

NGS biedt een reproduceerbare, zeer gevoelige aanpak die de noodzaak van patiëntspecifieke primers wegneemt. Het maakt een betrouwbare identificatie en kwantificering van unieke immunoglobulinerearrangementen bij hematologische maligniteiten mogelijk¹³. De Food and Drug Administration (FDA) heeft ClonoSEQ van Adaptive Biotechnologies goedgekeurd voor MRD-testen bij patiënten met acute lymfoblastische leukemie (ALL), MM en chronische lymfatische leukemie (CLL)^14,15,16. Talrijke internationale klinische richtlijnen bevelen NGS inmiddels aan als methode voor MRD-monitoring. De Chinese Guidelines for the Diagnosis and Treatment of MM (Revised 2020) ondersteunen evenzo de MRD-evaluatie bij MM-patiënten met gebruik van methoden zoals next-generation flowcytometrie (NGF) en NGS¹⁷.

Voor zover wij weten, is NGS-technologie in de klinische praktijk geen voorkeursmethode voor de detectie van MRD bij lymfoïde maligniteiten vanwege beperkingen in kosten en tijd. Wanneer MFC-resultaten negatief zijn, is vaak een aanvullende beenmergaspiratie noodzakelijk om MRD te detecteren. Deze aanvullende procedure kan een aanzienlijke fysieke en psychologische belasting voor patiënten vormen, wat de brede klinische toepassing mogelijk beperkt.

In deze studie hebben we een op NGS gebaseerde B- of T-celreceptor (BCR/TCR) clonaliteitsanalyse (OriMIRACLE LTM) ontwikkeld, gekarakteriseerd en de prestaties ervan gevalideerd. De primaire doelstellingen van deze studie waren om de sensitiviteit en specificiteit van deze analyse te valideren voor het volgen van MRD bij lymfoïde maligniteiten, zelfs bij het gebruik van residuele uitstrijkjes. Deze methode kan direct gebruikmaken van residuele beenmergutstrijkjes die overblijven na de routinediagnose, waardoor de inherente beperkingen van uitstrijkjes worden overwonnen. Zelfs wanneer het DNA in de uitstrijkjes gefragmenteerd is door fixatie, kleuring en langdurige opslag, in extreem lage hoeveelheden aanwezig is of gedeeltelijk is gedegradeerd, kunnen betrouwbare immuunrepertoireprofielen worden verkregen via geoptimaliseerde nucleïnezuurextractie en multiplex PCR-amplificatie. Dit maakt clonale tracking met een hoge sensitiviteit mogelijk, met een sensitiviteit van 10⁻⁵ tot 10⁻⁶, wat de onderste detectielimiet van conventionele flowcytometrie-gebaseerde MRD overtreft. Dit werk benadrukt het potentieel van NGS-gebaseerde BCR/TCR-clonaliteitsbeoordeling bij het verbeteren van MRD-tracking en het informeren van behandelbeslissingen voor patiënten met MM, wat mogelijk de huidige beperkingen in de klinische praktijk aanpakt.

Protocol

Deze studie is uitgevoerd in overeenstemming met de principes van de Verklaring van Helsinki en is goedgekeurd door de ethische commissie van het First Affiliated Hospital van de Gannan Medical University (ethische goedkeuringsnummer: 22SC-2023011201). Van alle deelnemers is voorafgaand aan hun opname in de studie schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen.

Monsterselectie
Klinische monsters werden verkregen van 40 patiënten gediagnosticeerd met diverse hematologische maligniteiten, waaronder ALL, MM, CLL en lymfoom. Daarnaast werden gepaarde monsters uit de chronische en blastenfase verzameld van patiënten met chronische myeloïde leukemie. De monsters werden verkregen bij het First Affiliated Hospital of Gannan Medical University, Jiangxi, China, tussen december 2016 en augustus 2022. Deze specimens waren afkomstig uit beenmergaspiraten (BMA) of perifeer bloed. Vier cellijnen van lymfoïde maligniteiten werden ook gebruikt: de B-ALL-lijnen REH en NALM6, de T-ALL-lijn Jurkat en de lymfoomlijn H9, alle verkregen van de American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA).

Voor de analytische validatiestudie werd een subset van gepaarde klinische residuen van beenmerguitstrijkjes opgenomen, die vóór en na de behandeling waren afgenomen bij 30 patiënten met nieuw gediagnosticeerde of recidiverende MM. MFC-assays werden uitgevoerd op BMA-monsters op de overeenkomstige tijdstippen met behulp van 4-kleuren flowcytometrie.

De monsters werden gekleurd met zes verschillende 4-kleurige antilichaamcombinaties (verdunningen volgens de instructies van de fabrikant): CD38/CD56/CD45/CD19, CD38/CD138/CD45/CD34, CD38/CD117/CD45/CD33, CD38/CD22/CD45/CD20, CD38/CD9/CD45/HLA-DR en K/L/CD45/CD38. De kleuring werd gedurende 30 min bij 4 °C in het donker uitgevoerd, gevolgd door twee wasstappen met PBS (centrifugatie bij 500 × g gedurende 5 min bij 4 °C). In immunohematologische laboratoria wordt MFC-MRD-positiviteit in het beenmerg momenteel gedefinieerd aan de hand van een drempelwaarde van 10^-4 (1 cel in 10.000). De kwaliteit van de flowcytometrie-acquisitie werd geverifieerd door de forward/side scatter te visualiseren en te bevestigen dat er ten minste 10.000 CD45⁺ events per buis aanwezig waren.

Kloonaliteitsdetectie en MRD-tracking via de NGS-gebaseerde kloonaliteitsassay
gDNA werd geëxtraheerd uit 200 µL BMA, perifeer bloed of een volledig residu-uitstrijkje (opgelost in 200 µL PBS) met behulp van de overeenkomstige kit volgens de instructies van de fabrikant. Een minimale gDNA-concentratie van 20 ng/µL en een totale opbrengst van ≥ 1 µg waren vereist. Een A260/A280-ratio van 1,8–2,0 werd geverifieerd. Deze assay amplificeert gDNA met behulp van locus-specifieke multiplex PCR met primers, gevolgd door de toevoeging van een reactiespecificiteitsindex-barcode aan de geamplificeerde receptorsequentie voor monsteridentificatie. Het gebarcodeerde, geamplificeerde DNA wordt vervolgens samengevoegd om sequencing-libraries voor te bereiden, die worden onderworpen aan NGS met het Illumina-platform. Een uiteindelijke library-grootte van 350–450 bp en een concentratie van ≥ 5 nM werden geverifieerd op de Bioanalyzer. Sequencing-gegevens worden verwerkt met behulp van aangepaste bioinformatica-pipelines en strikte kwaliteitscontrolemaatregelen. Reads worden voor elk monster toegewezen aan gerearrangeerde BCR's of TCR's en samengevoegd tot clonale receptorsequenties. Deze sequenties worden vervolgens beoordeeld op hun ziektegerelateerde potentieel en geschiktheid voor daaropvolgende tracking. Om als geschikt te worden beschouwd, moet een sequentie ten minste 10% van alle BCR-sequenties op de betreffende locus uitmaken en voldoende uniek zijn. Bij het evalueren van een sequentie voor MRD-tracking wordt de uniciteit bepaald door deze te vergelijken met een uitgebreide B- of T-celrepertoiredatabase, zoals de ImMunoGeneTics (IMGT) database (http://www.imgt.org). De frequentie van de sequentie binnen deze database wordt gebruikt om de distinctiviteit te beoordelen. Zodra geschikte ziektegerelateerde sequenties zijn geïdentificeerd, worden deze vergeleken met daaropvolgende monsters om MRD te monitoren. Monsters worden geclassificeerd als MRD-positief (+) als er overeenkomstige sequenties worden gevonden, of MRD-negatief (-) als er geen overeenkomsten worden gedetecteerd. De concentratie van elke gemonitorde sequentie wordt gekwantificeerd, wat de berekening van consensus maligne cel- en totale kernhoudende cel-aantallen op monsterniveau mogelijk maakt. De ratio tussen deze cijfers geeft een schatting van de tumorcel-frequentie binnen een monster, wat waardevolle inzichten biedt in ziekteprogressie of remissie. Een clonale sequentie werd als geldig beschouwd voor tracking als er ten minste 50 ondersteunende reads werden gedetecteerd en de sequentie ≥10% van het totale BCR/TCR-repertoire bij diagnose uitmaakte.

Alle monsters van menselijke oorsprong werden behandeld als biologisch gevaarlijk in een klasse II biologische veiligheidskabinet (BSC) met persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE). Gecontamineerde verbruiksartikelen werden geautoclaveerd (121 °C, 20 min) vóór verwijdering; vloeibaar afval werd behandeld met 10% bleekmiddel.

Precisie- en sensitiviteitsstudies
De detectielimiet (LOD) werd bepaald met behulp van klinische monsters en cellijnen tegen een achtergrond van perifeer bloed-gDNA van gezonde donoren. Om de lineariteit van de detectie vast te stellen, werd gDNA van cellijnen toegevoegd aan normaal gDNA om een reeks clonale frequenties te creëren over meerdere grootteordes. Specifiek werden maligne cellen toegevoegd beginnend bij 10 cellen, gevolgd door 10-voudige seriële verdunningen: 10, 100, 1.000 en 10.000 cellen. De LOD werd berekend als het verwachte aantal maligne inputcellen waarbij de gefitte probit-curve een detectiekans van 95% bereikte. De consistentie tussen de waargenomen en verwachte frequenties werd geanalyseerd met behulp van lineaire regressie. Deze parameters bieden een robuuste basis voor de schatting van MRD op monsterniveau in daaropvolgende evaluatiestudies. Deze verfijnde versie behoudt de academische toon terwijl de duidelijkheid en beknoptheid zijn verbeterd. Het waarborgt tevens het juiste gebruik van wetenschappelijke terminologie en houdt zich aan de conventies van wetenschappelijk schrijven in het veld van de levenswetenschappen en geneeskunde.

Statistische analyse
Een tweezijdige p < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant. Lineariteit werd beoordeeld en berekend met behulp van de correlatiecoëfficiënt van Pearson (r) in GraphPad Prism. De statistische analyse werd uitgevoerd met de taal R (versie 3.6.1). De berekening van de progressievrije overleving (PFS) begint op het moment dat de patiënt een complete respons (CR), partiële respons (PR) of zeer goede partiële respons (VGPR) bereikt, en loopt door tot het optreden van progressieve ziekte (PD) of overlijden door welke oorzaak dan ook. De Kaplan-Meier-curve werd gebruikt om de overleving te analyseren, en de log-ranktest werd gebruikt om het verschil in overleving tussen subgroepen te vergelijken. De Cox-analyse werd uitgevoerd met behulp van zowel univariate als multivariate analyses.

Resultaten

Verwerking, lineariteit en precisie van clonaliteitsdetectie
De BCR/TCR-clonaliteitsassays waren gebaseerd op twee ronden multiplex PCR gevolgd door NGS (Figuur 1). De BCR-clonaliteitsassays konden IGH (VH-DH-JH of DH-JH), IGK (Vκ-Jκ, Vκ-Kde en intronRSS-Kde) en IGL (Vλ-Jλ) herschikkingen identificeren, evenals BCL1-IGH en BCL2-IGH translocaties met behulp van afzonderlijke reacties of een enkele aangepaste gemengde reactie. TCR-clonaliteitsassays konden TCRB (Vβ-Dβ-Jβ) en TCRG (Vγ –Jγ) herschikkingen detecteren. De BCR-clonaliteit van B-cellymfomeuze maligniteiten vertoonde een detectiepercentage van 93,94% en de TCR-clonaliteit van T-cellymfomeuze maligniteiten vertoonde een detectiepercentage van 90,91% (Tabel 1).

Lineariteit werd aangetoond over een breed bereik van monsterinputs (0,2 µg, 2 µg en 20 µg) op basis van de resultaten van cellijnonderzoeken, verspreid over verschillende grootteordes. Om de lineariteit vast te stellen, werden maligne cellen toegevoegd aan normaal gDNA met behulp van 10-voudige seriële verdunningen (10, 100, 1.000 en 10.000 cellen). De lineariteit werd waargenomen met geschatte hellingen van 0,93–1,06 bij clonale frequenties van 1 tot 10^-6 (Figuur 2A). De LOD werd geschat op tussen de 1 en 2 maligne cellen in zowel de BCR- als de TCR-clonaliteitsassays (Figuur 2B). Bovendien waren de BCR/TCR-clonaliteitsassays in staat om clonaliteit bij lymfoom aan te tonen met gebruik van weefselmonsters (BMA) en matching perifeer bloed (Aanvullende Tabel 1).

Patiënten en monsters gebruikt voor de validatie van MRD-detectie
De validatie van de MRD-detectie omvatte in totaal 29 patiënten met MM, waarbij één patiënt werd uitgesloten vanwege monsterschade. De studiepopulatie bestond uit 65,52% (19/29) mannen en 34,48% (10/29) vrouwen, met een mediane leeftijd van 65 jaar (bereik 33–82) (Tabel 2). Binnen de cohort werden 31,03% (9/29) van de patiënten geclassificeerd als hoogrisico, 24,14% (7/29) als standaardrisico en 37,93% (11/29) als laagrisico volgens de IMWG-criteria¹⁸. De stadia I, II en III van het revised multiple myeloma international staging system (R-ISS) waren respectievelijk vertegenwoordigd door 10,34% (3/29), 48,28% (14/29) en 20,69% (6/29) van de patiënten¹⁹.

Vergelijking van NGS- en MFC-assays
Er werd een directe paarsgewijze vergelijking uitgevoerd om de kwantitatieve nauwkeurigheid van de OriMIRACLE LTM- en MFC-assays te evalueren. De resultaten toonden een vergelijkbare kwantitatieve nauwkeurigheid over het geteste bereik, in het bijzonder bij MRD-frequenties boven 10⁻⁴, met een Pearson R-waarde van 0,73 (Figuur 3). Tumorcellen werden door zowel MFC- als NGS-assays gedetecteerd in 59 monsters van 29 MM-patiënten, waarbij de consistentie 81,36% (48/59) bedroeg. Deze consistentie weerspiegelt de aanwezigheid van detecteerbare tumorcellen over verschillende tijdstippen, in plaats van een werkelijke concordantie tussen de methoden. Van de monsters werd 62,07% (18/29) als MRD+ getest door zowel de NGS- als de MFC-assays, één patiënt werd door beide methoden als MRD− getest, en 11 patiënten werden als MRD+ getest door NGS maar als MRD− door MFC. Van de patiënten met inconsistente detectieresultaten hadden drie een detectiefrequentie onder 10^-4, terwijl acht een detectiefrequentie hadden binnen het bereik van 10^-2–10^-4 (Figuur 3). DNA-extractie uit resterende beenmergutstrijkjes wordt uitgevoerd om zoveel mogelijk DNA te verkrijgen. Voor de detectie van clonaliteit vóór de behandeling werd een gemiddelde DNA-input van 91,95 ng (tot 100,0 ng) getest. Voor daaropvolgende MRD-testen werd gemiddeld 1623,39 ng (variërend van 50,1–17400,0 ng) DNA geëxtraheerd (Aanvullende Tabel 2). Hieruit bleek dat NGS MRD kan detecteren, zelfs wanneer het resterende monster onvoldoende is, terwijl MFC in sommige gevallen geen MRD kon detecteren.

Klinische validiteit van MRD-detectie via NGS-assay voor het lead interval
Klonale sequenties werden bij baseline gedetecteerd bij alle MM-patiënten, gevolgd door de beoordeling van MRD (Figuur 4). Bij achttien patiënten werd MRD+ bevestigd via NGS- en MFC-detectie. Van de patiënten die MRD+ waren via zowel MFC als NGS, ervoer 61,11% (11/18) vervolgens PD of een recidief. 38,89% (7/18) van de patiënten bereikte een stabiele ziekte (SD) of PR tijdens de studie. Van de patiënten die via NGS als MRD+ maar via MFC als MRD− waren bevestigd, kon 36,36% (4/11) bij de meest recente klinische evaluatie geen klinische CR bereiken (Aanvullende Tabel 2). Bovendien ervoer, van alle patiënten bij wie de klinische respons CR was, 37,50% (3/8) een recidief na het staken van de behandeling. We hebben ook de primaire klinische kenmerken en MFC-resultaten onderzocht in relatie tot de PFS-uitkomst (Aanvullende Figuur 1). Univariabele en multivariabele analyses van de PFS wezen uit dat deze niet significant gerelateerd waren. In deze studie werd geen significant verschil in de PFS waargenomen wanneer alleen de MRD-resultaten verkregen via MFC werden geanalyseerd.

DATABESCHIKBAARHEID
Vanwege beperkingen met betrekking tot de privacy van patiënten en institutionele richtlijnen zijn de ruwe data niet publiekelijk beschikbaar. Een samenvatting van de verzamelde data is opgenomen in Aanvullend Bestand 1.

Figuur 1: De BCR/TCR-klonaliteitsanalyse bestond uit multiplex PCR gevolgd door NGS. De eerste ronde PCR amplificeerde de CDR3-regio van gerearrangeerde immuunreceptorgenen met behulp van locus-specifieke primers en monster-specifieke indices, en NGS-adapters werden toegevoegd tijdens de tweede ronde PCR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: De lineariteit van de clonaliteitsdetectie werd beoordeeld door cellijn-gDNA toe te voegen aan normaal gDNA over een reeks clonale frequenties. (A) Lineariteit van BCR- en TCR-clonaliteitsassays. (B) Detectielimiet (LOD) geschat met behulp van klinische monsters en cellijnen toegevoegd aan gDNA van perifeer bloed van gezonde donoren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Paarsgewijze vergelijking van MRD-frequentiemetingen tussen MFC en de NGS MRD-assay. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: De MRD-dynamiek van MM-patiënten en de verschillende klinische statussen van de patiënten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Monster-typen		Nr.	Ziektebeeld	Dominante clonotype
Cellijnen	REH	1	B-ALL	IGH, IGK
	NALM6	2	B-ALL	IGH, IGK
	Jurkat	3	T-ALL	TCRB, TCRG
	H9	4	Lymfoom	TCRB, TCRG
Klinische B-cel lymfoïde maligniteiten		5	B-ALL	IGH
		6	B-ALL	IGL
		7	B-ALL	IGH
		8	B-ALL	Niet gedetecteerd
		9	CLL	IGH, IGK
		10	CLL	IGH, IGK
		11	CP-CML	IGH
		12	BP-CML	IGH
		13	MM	IGK
		14	MM	IGH, IGK
		15	MM	IGK
		16	MM	IGH
		17	MM	IGH
		18	MM	IGK
		19	MM	IGH
		20	MM	IGH, IGK
		21	MM	IGH, IGK
		22	MM	IGH
		23	Lymfoom	IGH, IGK
		24	Lymfoom	IGH, IGK, IGL
		25	Lymfoom	IGH, IGK, IGL
		26	Lymfoom	IGH, IGK, IGL
		27	Lymfoom	IGH
		28	Lymfoom	IGH
		29	Lymfoom	IGH, IGK, IGL
		30	Lymfoom	IGH, IGK
		31	Lymfoom	IGH, IGK
		32	Lymfoom	IGH, IGK, IGL
		33	Lymfoom	IGK
		34	Lymfoom	IGH
		35	Lymfoom	Niet gedetecteerd
Klinische T-cel lymfoïde maligniteiten		36	Lymfoom	TCGR
		37	Lymfoom	TCRB, TCRG
		38	Lymfoom	TCRB, TCRG
		39	Lymfoom	TCRB, TCRG
		40	Lymfoom	TCRB, TCRG
		41	Lymfoom	TCRB, TCRG
		42	Lymfoom	TCRB, TCRG
		43	Lymfoom	TCRB, TCRG
		44	Lymfoom	Niet gedetecteerd

Tabel 1: Detectie van clonaliteit met behulp van BCR/TCR-clonaliteitsassays in 4 cellijnen en 40 klinische monsters. B-ALL: B-cel acute lymfatische leukemie; T-ALL: T-cel acute lymfatische leukemie; CP-CML: Chronische fase van chronische myeloïde leukemie; BP-CML: Blastenfase van chronische myeloïde leukemie; CLL: Chronische lymfatische leukemie; MM: Multiple myeloom.

Kenmerk	Totaal (N = 29)
Mediaan leeftijd, jaar (bereik)	65 (33-82)
Geslacht, n (%)
Man	19 (65.52)
Vrouw	10 (34.48)
Zware ketentype, n (%)
IgG	14 (48.28)
IgA	7 (24.14)
IgE	1 (3.45)
Lichte ketentype, n (%)
k	19 (65.52)
λ	8 (27.59)
Cytogenetische abnormaliteit, n (%)
del17p	2 (6.90)
del13q14	9 (31.03)
1q21 gain/amp	12 (41.38)
t (4;14)	2 (6.90)
Geen abnormaliteiten	9 (31.03)
ISS-stadium, n (%)
I	4 (13.79)
II	13 (44.83)
III	12 (41.38)
R-ISS-stadium, n (%)
I	3 (10.34)
II	14 (48.28)
III	6 (20.69)
Ontbrekend	6 (20.69)
IMWG, n (%)
Hoog risico	9 (31.03)
Standaard risico	7 (24.14)
Laag risico	11 (37.93)
Ontbrekend	2 (6.90)

Tabel 2: Baselinekenmerken van de 29 MM-patiënten die aan deze studie deelnamen. k: kappa; λ: Lambda; DS: Durie-Salmon; ISS: International staging system; R-ISS: herziene International staging system; IMWG: International Myeloma Working Group

Aanvullende figuur 1: Overlevinganalyse gebaseerd op klinische kenmerken en MFC-resultaten. (A) Univariabele en multivariabele analyses van de PFS. (B) Kaplan-Meier-curve met MFC-resultaat. (C) Kaplan-Meier-curve met NGS-resultaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Detectie van clonaliteit van lymfoom met behulp van BCR/TCR-clonaliteitsassays in weefselmonsters en bijbehorend perifeer bloed.NHL: non-hodgkinlymfoom; HGBL: high-grade B-cellymfoom; FL: folliculair lymfoom; DLBCL: diffuus grootcellig B-cellymfoom; ITLPD-GI: indolente T-lymfoproliferatieve aandoeningen van het maagdarmstelsel. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: De resultaten van MRD-detectie op basis van MFC- en NGS-assays. ND: niet gedetecteerd; Partiële respons: PR; Complete respons: CR; Stabiele ziekte: SD; Zeer goede partiële respons: VGPR. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Samenvatting van de ruwe gegevens die in deze studie zijn verzameld. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De afgelopen jaren zijn er aanzienlijke verbeteringen opgetreden in de klinische uitkomsten voor lymfoïde maligniteiten, wat heeft geleid tot een zoektocht naar alternatieve markers die in staat zijn om overlevingsendpunten eerder te voorspellen en de evaluatie van nieuwe therapieën te versnellen²⁰. Een uitgebreide meta-analyse met 8.098 patiënten heeft de robuuste prognostische waarde van MRD-negativiteit bevestigd bij het verbeteren van de langetermijnoverleving bij MM-patiënten²¹. Bovendien zijn BCR- en TCR-klonale herschikkingen naar voren gekomen als cruciale diagnostische markers en markers voor MRD-tracking, die behandelbeslissingen bij maligniteiten van het lymfestelsel sturen²².

Toenemend bewijs ondersteunt de superioriteit van NGS-gebaseerde BCR/TCR-klonaliteitsbeoordeling ten opzichte van MFC- en PCR-gebaseerde assays, met name wanneer er voldoende DNA-monsters beschikbaar zijn. NGS biedt een hogere sensitiviteit en eenvoudigere standaardisatie^{10,23,24,25,26} en is geïdentificeerd als een sterke prognostische factor voor zowel PFS als algehele overleving bij de start van onderhoudstherapie²⁷.
In deze studie hebben we de NGS-gebaseerde assay ontwikkeld, die een positieve detectiegraad van meer dan 90% laat zien voor zowel BCR- als TCR-klonaliteit bij lymfoïde maligniteiten. De LOD van de assay wordt geschat tussen 1 en 2 maligne cellen voor zowel de BCR- als de TCR-klonaliteitsassays, wat vergelijkbaar is met de hoge sensitiviteit van de clonoSEQ Assay met een LOD van 1,903 maligne cellen¹⁶. We observeerden lineariteit met geschatte hellingen variërend van 0,93 tot 1,06 over clonale frequenties van 1 tot 10^-6, wat duidt op een sterke proportionaliteit tussen de geobserveerde en verwachte clonale frequenties. Na de vaststelling van gestandaardiseerde detectiemethoden en de voltooiing van de laboratoriumvalidatie, hebben we klinische validatie uitgevoerd om de geschiktheid van de assay voor klinische MRD-monitoring te waarborgen.

Deze studie toonde een consistentie van 81,36% (48/59) aan tussen de op NGS gebaseerde assay en MFC. Beide methoden vertoonden een sensitiviteit van 100% bij het identificeren van tumorcellen in nieuw gediagnosticeerde of recidiverende gevallen. Voor monitoring na de behandeling stelden we geen significante correlatie vast tussen de via MFC beoordeelde MRD-status en PFS, waarschijnlijk vanwege de beperkte steekproefomvang. Bijgevolg hebben we een uitgebreide analyse van alle gevallen uitgevoerd.

Van de 18 patiënten die met beide methoden als MRD-positief werden geïdentificeerd, kwamen de MRD-resultaten overeen met de klinische responsbeoordelingen. Negen van deze patiënten vertoonden PD of een recidief, vier bereikten SD, vier bereikten PR en één overleed. Dit suggereert dat voor patiënten die met beide methoden MRD-positief testen, PD of een recidief bijna onvermijdelijk wordt waargenomen. Deze gegevens suggereren dat MRD-positiviteit bij zowel NGS- als MFC-assays grotendeels wijst op beperkte effectiviteit of een slechte prognose bij deze patiënten. Van de 11 patiënten die MRD-positief testten via NGS maar MRD-negatief via MFC, bereikte 36,36% geen CR. Deze bevindingen onderstrepen het vermogen van NGS om MRD te detecteren bij frequenties variërend van 10^-2 tot 10^-6, zelfs bij beperkte residuele monsters, terwijl MFC in sommige gevallen geen MRD kon detecteren. Dit ondersteunt verder de hogere sensitiviteit en specificiteit van NGS bij MRD-detectie in vergelijking met MFC.

Eerder onderzoek heeft aangetoond dat de MRD-status beoordeeld via MFC een sterke voorspeller is voor de PFS en de algehele overleving bij MM-patiënten, wat het belang onderstreept van MRD-monitoring bij het sturen van behandelbeslissingen en het beoordelen van de prognose na autologe stamceltransplantatie²⁸. De resultaten hier benadrukken verder het belang van NGS-assays, zoals geïllustreerd door twee gevallen (patiënten 11 en 14) waarbij patiënten MRD-negatief testten via MFC maar MRD-positief via NGS. Het is cruciaal om op te merken dat het staken van de behandeling in dergelijke gevallen kan leiden tot een risico op recidief, wat de noodzaak onderstreept van een zorgvuldige evaluatie van de behandelrespons wanneer discordante MRD-resultaten worden waargenomen.

Deze studie doorbreekt de afhankelijkheid van bestaande NGS- en MFC-methoden van verse beenmergaspiraten of ingevroren cellen en valideert voor het eerst systematisch dat residuele, gekleurde beenmergutstrijkjes die overblijven na routinediagnostiek kunnen dienen als betrouwbaar startmateriaal voor hooggevoelige MRD-detectie. Dit pakt direct de volgende klinische en methodologische tekortkomingen aan: (1) het vermijdt de noodzaak om grote volumes beenmergvloeistof af te nemen voor MRD-monitoring, vooral bij oudere patiënten of patiënten bij wie bemonstering moeilijk is; (2) het maakt retrospectieve analyse van gearchiveerde uitstrijkjes mogelijk, waardoor bestaande pathologische bronnen kunnen worden benut om MRD-gebaseerd prognostisch bewijs in historische cohorten vast te stellen; en (3) met een detectiegevoeligheid van 10^-5-10^-6 is het superieur aan conventionele MFC (typisch 10^-4-10^-5) en omzeilt het de fout-negatieven veroorzaakt door problemen met de monsterkwaliteit bij MFC, waardoor een DNA-gebaseerd, traceerbaar MRD-beoordelingsinstrument voor de klinische praktijk wordt geboden.

Er werden verschillende kritische stappen geïdentificeerd om het succes en de betrouwbaarheid van de assay te waarborgen. Voorzichtig afschrapen van residuele uitstrijkjes, gevolgd door onmiddellijke toevoeging van buffer, was essentieel voor het verkrijgen van een adequate gDNA-opbrengst. Een precieze hoeveelheid input-DNA (100 ng per reactie, binnen ±10%) was vereist om allele dropouts of bevooroordeelde amplificatie te voorkomen. Equimolaire pooling van gebarcodeerde producten (2 nM) droeg bij aan een uniforme sequencingdiepte, en de consistente toepassing van bio-informatische drempelwaarden (≥10% clonale frequentie bij diagnose en ≤5% mismatches voor tracking) hielp vals-positieve MRD-calls te voorkomen. Daarnaast werden verschillende wijzigingen in het standaardprotocol geïntroduceerd om veelvoorkomende experimentele problemen aan te pakken. Wanneer de uiteindelijke bibliotheekconcentratie onder de 5 nM zakte, werd voorzichtig een tweede PCR-ronde met 2–4 extra cycli toegevoegd om over-amplificatiebias te vermijden. Voor monsters waarbij clonale tracking mislukte door excessieve mismatches (>5%), werd de referentie IMGT-database bijgewerkt en werd de mismatch-tolerantie tijdelijk versoepeld naar 8% voor exploratieve analyse, hoewel 5% de standaard afkapwaarde bleef voor klinische rapportage. Als de sequencingdiepte onder de 50.000 reads per monster zakte, werden re-pooling en re-sequencing uitgevoerd zonder de PCR-stap te herhalen.

Over het algemeen demonstreert deze validatie in de praktijk dat residuele monsters van beenmerguitstrijkjes consistente en betrouwbare testresultaten opleveren in diverse behandelingsomgevingen. In economisch achtergestelde gebieden waar beenmergbiopsie en MFC routinematig worden uitgevoerd in plaats van NGS, suggereren de bevindingen dat NGS kan worden overwogen voor verdere moleculaire evaluatie wanneer de initiële resultaten negatief zijn. Het gebruik van residuele monsters is in dergelijke situaties passend, omdat het de noodzaak voor herhaalde beenmergaspiratie wegneemt, waardoor de belasting voor de patiënt wordt verminderd.

Hoewel onze lopende real-world studie tot doel heeft de steekproefomvang te vergroten voor verdere analyse, erkennen we verschillende beperkingen. Er kunnen fout-negatieven optreden, met name wanneer de hoeveelheid geëxtraheerd DNA onvoldoende is, zoals waargenomen bij de tweede MRD-detectie voor patiënt 10. Daarnaast wordt de proportie klonen die door NGS wordt gedetecteerd beïnvloed door de celkwantificering, wat mogelijk leidt tot een overschatting van de MRD-celproporties. De validatie richt zich primair op beenmergmonsters. De langetermijnbetekenis van NGS-MRD ligt echter in meerdere follow-ups na de behandeling, waarbij perifeer bloed geschikter kan zijn. Validatie van perifere bloedmonsters is nog niet uitgevoerd. Gezien het beperkte aantal klinische validatiemonsters, de willekeurige inschrijving van patiënten en de diverse behandelingsbenaderingen in deze real-world studie, bleek het verzamelen van opeenvolgende MRD-monsters uitdagend. Bijgevolg hebben we ons gericht op het beoordelen van de betekenis van vroege MRD-responsen in relatie tot daaropvolgende progressie, en konden we de impact van een aanhoudende MRD-status op langetermijnuitkomsten niet aantonen. Bovendien werd NGF niet opgenomen in de vergelijkende analyse. Hoewel NGS en conventionele MFC systematisch werden vergeleken, zou NGF, als een van de twee door de IMWG aanbevolen MRD-methoden (de andere is NGS), aanvullend inzicht hebben gegeven in de prestaties van de assay. Verder is de steekproefomvang relatief klein (n = 40) en is de cohort heterogeen, met verschillende hematologische maligniteiten. Toekomstige multicentrische grootschalige studies waarin NGF wordt betrokken en die zich richten op één enkele maligniteit, zoals multipel myeloom, zijn gerechtvaardigd om onze conclusies te bevestigen en uit te breiden.

Nadat we de prestaties van de op NGS gebaseerde BCR/TCR-klonaliteitsassay grondig hadden gekarakteriseerd en gevalideerd, hebben we aangetoond dat deze potentie heeft als een zeer gevoelige, nauwkeurige en praktische methode voor het kwantificeren en monitoren van MRD in resterende beenmergutstrijkjes van MM-patiënten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-CD19	Abcam	AB134114	Verdunning volgens instructies van de fabrikant
Anti-CD20	Abcam	AB64088	Verdunning volgens instructies van de fabrikant
Anti-CD22	Abcam	AB32123	Verdunning volgens instructies van de fabrikant
Anti-CD33	Abcam	AB134115	Verdunning volgens instructies van de fabrikant
Anti-CD34	Abcam	AB81289	Verdunning volgens instructies van de fabrikant
Anti-CD38	Abcam	AB183326	Verdunning volgens instructies van de fabrikant
Anti-CD45	Abcam	AB40763	Verdunning volgens instructies van de fabrikant
Anti-CD56	Abcam	AB75813	Verdunning volgens instructies van de fabrikant
Anti-CD9	Abcam	AB2215	Verdunning volgens instructies van de fabrikant
Anti-HLA-DR	Abcam	AB20181	Verdunning volgens instructies van de fabrikant
GraphPad Prism	GraphPad	https://www.graphpad.com/
Illumina NovaSeq 6000	Illumina	NovaSeq 6000	https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/novaseq.html
ImMunoGeneTics (IMGT) database	ImMunoGeneTics (IMGT) database	http://www.imgt.org/
Cellijnen van lymfoïde maligniteiten	ATCC	https://www.atcc.org/	B-ALL-lijnen REH en NALM6, T-ALL-lijn Jurkat en lymfoomlijn H9 (DSMZ)
Multiparameter flowcytometrie	BECKMAN COULTER	CytoFLEX
OriMIRACLE LTM assay	Origimed Co., Ltd., Shanghai, China
R-taal	R Foundation for Statistical Computing	versie 3.6.1