Een praktische workflow voor de analyse van ruimtelijke transcriptomics-gegevens: van gegevensverwerving tot geavanceerde analyses

Samenvatting

Dit protocol presenteert een reproduceerbare workflow voor het analyseren van ruimtelijke transcriptomics-gegevens en begeleidt gebruikers bij de acquisitie van openbare gegevens en Seurat-gebaseerde kwaliteitscontrole, gevolgd door integratie, detectie van ruimtelijke kenmerken, deconvolutie van celtypen, annotatie van regio's van belang en analyse van cel-celcommunicatie, inclusief praktische controlepunten die een transparante uitvoering ondersteunen.

Samenvatting

Ruimtelijke transcriptomics (ST) brengt genexpressie op genoombrede schaal in kaart terwijl de tweedimensionale ruimtelijke context van mRNA-moleculen binnen weefselcoupes behouden blijft, wat studies naar weefselarchitectuur en biologie geassocieerd met de micro-omgeving mogelijk maakt. De analyse van ST blijft echter uitdagend omdat data-import, kwaliteitscontrole, integratie, deconvolutie, ruimtelijke statistiek en visualisatie vaak meerdere softwareomgevingen en reproduceerbare parameterkeuzes vereisen. Dit protocol presenteert een praktische computationele workflow in R voor openbare ST-datasets, beginnend bij data-acquisitie en software-installatie, gevolgd door data-laden via Seurat, kwaliteitscontrole, normalisatie, integratie van meerdere monsters, clustering en analyse van ruimtelijk variabele genen. Vervolgens past de workflow complementaire deconvolutiestrategieën toe, waaronder referentie-gestuurde SPOTlight-analyse en ongesuperviseerde STdeconvolve topic-modellering, gevolgd door een Giotto-gebaseerde analyse van ruimtelijke cel-celcommunicatie en interactieve selectie van regio's van interesse (ROI) met behulp van een aangepaste Python Dash-applicatie. Door de nadruk te leggen op script-gebaseerde uitvoering, expliciete onderbouwing van parameters, verwachte resultaten en controlepunten voor probleemoplossing, biedt het protocol een aanpasbaar kader voor standaard array-gebaseerde ST-datasets en gerelateerde platforms na evaluatie van dataset- en platformspecifieke parameters.

Inleiding

Ruimtelijke transcriptomica (ST) is een transformatieve familie van technologieën die genoombrede genexpressie meet terwijl de ruimtelijke coördinaten van messenger RNA (mRNA)-moleculen binnen weefselcoupes behouden blijven. ST-methoden omvatten op sequencing gebaseerde benaderingen die gebruikmaken van arrays met positie-barcodes en in situ imaging-benaderingen die transcriptionele signalen in kaart brengen binnen intacte weefselmicro-omgevingen^1,2. Door de ruimtelijke context te behouden, maakt ST de analyse mogelijk van weefselarchitectuur, de organisatie van cellulaire nabuurschappen, cel-celcommunicatie en biologische processen geassocieerd met de micro-omgeving die niet volledig kunnen worden ontrafeld na weefseldissociatie³.

De snelle groei van openbare ST-datarepositoria heeft ongekende mogelijkheden gecreëerd voor secundaire analyse en methodeontwikkeling³. Bronnen zoals de CROST-database cureren honderden ruimtelijk opgeloste transcriptomische datasets over meerdere soorten en technologieplatforms, terwijl gespecialiseerde collecties zoals STOmicsDB zich richten op specifieke methodologieën zoals Stereo-seq^4,5. Ondanks deze overvloed aan gegevens blijft computationele analyse uitdagend vanwege de complexiteit van ruimtelijke datastructuren, de diversiteit aan analytische tools en technische belemmeringen bij het implementeren van reproduceerbare workflows^{6,7,8,9,10,11}.

Om de beperkingen van het vertrouwen op een enkele softwareomgeving aan te pakken, wordt hier een geïntegreerde computationele workflow gepresenteerd die gebruikmaakt van complementaire analytische tools. Bestaande uitgebreide ST-analyse-ecosystemen omvatten voornamelijk Seurat, Giotto en Python-gebaseerde frameworks zoals Squidpy^6,7,12. Hoewel Python-gebaseerde tools zoals Squidpy uitgebreide functionaliteiten bieden voor ruimtelijke graafanalyse, minimaliseert het consolideren van de primaire computationele pipeline binnen één programmeertaalomgeving de technische hindernissen tussen verschillende talen. Bijgevolg is de kernpipeline hoofdzakelijk in R geïmplementeerd om deze cross-language technische hindernissen te verminderen. Binnen deze R-gebaseerde workflow wordt Seurat gebruikt voor het laden van gegevens, kwaliteitscontrole, normalisatie, dimensionaliteitsreductie, visualisatie en multi-sample integratie, wat het veelvoorkomende gebruik ervan in workflows voor single-cell en ruimtelijke transcriptomica weerspiegelt. Vervolgens wordt Giotto gebruikt voor de constructie van ruimtelijke netwerken en ligand-receptor-gebaseerde cel-cel communicatieanalyse. Deze pipeline koppelt dus Seurat-gebaseerde pre-processing en integratie aan Giotto-gebaseerde ruimtelijke analyse, terwijl de gegevensoverdracht tussen de twee toolsets expliciet en reproduceerbaar blijft.

Binnen dit kader worden twee complementaire deconvolutiestrategieën geïmplementeerd: SPOTlight, een referentiegestuurde methode die scRNA-seq-gegevens gebruikt om celtypeproporties te schatten, en STdeconvolve, een ongesuperviseerde topic-modeling-methode die latente transcriptionele patronen identificeert^8,11. De resultaten bieden complementaire inzichten in de ruimtelijke cellulaire heterogeniteit, maar worden niet beschouwd als een kwantitatieve kruisvalidatie, tenzij gebruikers de optionele concordantieanalyse uitvoeren die in het protocol wordt beschreven. Een aangepaste Python Dash-applicatie, Select Spatial Spots, is geïntegreerd voor interactieve annotatie van regio's van belang (ROI) en exporteert standaard coördinaatgebaseerde annotatiebestanden die kunnen worden gebruikt in daaropvolgende downstream-analyses.

Wat betreft de praktische toepasbaarheid is deze workflow primair bedoeld voor standaard array-gebaseerde ST-gegevens (bijv. Visium met een resolutie van 55 µm) en kan deze na evaluatie van de parameters mogelijk worden aangepast aan andere weefseltypen. Belangrijke beperkingen moeten vóór de analyse in overweging worden genomen. Ten eerste is de referentie-gestuurde deconvolutie-module afhankelijk van een hoogwaardige, weefselspecifieke scRNA-seq-referentie. Ten tweede kunnen subcellulaire of near-single-cell platforms aangepaste voorbewerking, ruimtelijke bin-aggregatie of beeldgebaseerde celsegmentatie vereisen vóór integratie². De representatieve dataset van de muiscolon wordt gebruikt als demonstratiegeval om te laten zien hoe de workflow ruimtelijke domeinen en marker-gedefinieerde weefselorganisatie kan evalueren, en niet als bewijs voor universele platformcompatibiliteit.

Protocol

Alle biologische datasets die in dit protocol worden geanalyseerd, zijn openbaar toegankelijk en worden strikt voor demonstratiedoeleinden gebruikt. Specifieke data-accessienummers en bronrepositories worden in de relevante stappen vermeld. De oorspronkelijke datasets werden gegenereerd door de oorspronkelijke onderzoekers in overeenstemming met de institutionele ethische richtlijnen die van toepassing waren op elke bronstudie. Raadpleeg de Tabel met Materialen om alle vereiste software- en R-pakketversies te verifiëren.

Hardwarevereisten: Het benodigde computermgeheugen voor deze workflow schaalt mee met het aantal geanalyseerde monsters en spots. Voor een typische spatial transcriptomics-dataset (bijv. ongeveer 3.000 spots per monster over maximaal drie monsters) is een standaard workstation met minimaal 16 GB RAM voldoende om de pipeline uit te voeren. Echter wordt 32 GB RAM of hoger sterk aanbevolen om optimale prestaties en stabiliteit te garanderen, met name tijdens geheugenintensieve computationele stappen zoals SCTransform-normalisatie en matrixfactorisatie tijdens deconvolution.

1. Gegevensverwerving en voorbereiding van de mappenstructuur

1. Verkrijg openbare ruimtelijke transcriptomics-datasets (bijv. GEO-accessienummer GSE169749, met een indieningsdatum van 26 maart 2021 en een laatste update datum van 6 maart 2022) en referentiegegevens van single-cell RNA-seq (bijv. GEO-accessienummer GSE264408, met een indieningsdatum van 19 april 2024 en een laatste update datum van 10 december 2024).
2. Download het archief met ruwe gegevens (bijv. GSE169749_RAW.tar) uit de repository en pak het archief uit.
   OPMERKING: Voor de representatieve dataset die in dit protocol wordt gebruikt, bevat de uitgepakte map meerdere bestanden voor elk monster, waarbij de bestandsnamen doorgaans het GEO-monster-accessienummer bevatten (bijv. GSM5213483).
3. Organiseer de bestanden in een gestandaardiseerde mapstructuur die compatibel is met de Seurat Load10X_Spatial functie.
   1. Maak een hoofdmap voor gegevens aan (bijv. ./data/).
   2. Maak voor elk monster een aparte submap aan (bijv. ./data/sample_A1/).
   3. Verplaats (kopieer of verplaats) de volgende essentiële bestanden voor elk monster naar de betreffende submap.
      1. Plaats het bestand filtered_feature_bc_matrix.h5 in de hoofdsubmap van het monster.
      2. Maak een spatial/ submap aan binnen elke monstermap.
      3. Plaats de volgende bestanden in de spatial/ submap: tissue_positions_list.csv.gz, scalefactors_json.json.gz en tissue_hires_image.png.gz.
   4. Decomprimeer de .gz bestanden in de spatial/ map. Zorg ervoor dat de oorspronkelijke bestandsnamen exact blijven zoals vereist door de Load10X_Spatial functie (bijv. tissue_positions_list.csv).
      OPMERKING: De uiteindelijke, georganiseerde structuur voor naadloos laden moet dit patroon volgen, met monster A1 als voorbeeld:
      ./data/sample_A1/filtered_feature_bc_matrix.h5
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_positions_list.csv
      ./data/sample_A1/spatial/scalefactors_json.json
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_hires_image.png

2. Configuratie van de softwareomgeving

1. Installeer R (versie 4.4.3 of hoger).
2. Download de analysescripts (1_ReadSpatialData.R tot en met 8_Giotto_Communication.R) vanuit de GitHub-repository (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow, bij commit hash 2d85e18 voor reproduceerbaarheid).
3. Installeer de vereiste R-pakketten vanuit CRAN en Bioconductor door het script setup.R uit te voeren.
   OPMERKING: Een volledige lijst van de specifieke pakketversies die in deze workflow worden gebruikt, is opgenomen in de Table of Materials en is ook beschikbaar in het bestand session_info.txt binnen de bijbehorende GitHub-repository (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow).
4. Installeer Giotto Suite door de installatiecommando's uit de officiële documentatie uit te voeren.
   1. Ga naar de officiële installatie-URL om de setup-scripts op te halen: https://giottosuite.com/articles/installation.html
   2. Initialiseer de vereiste Python-omgeving en systeemafhankelijkheden volgens de stapsgewijze instructies.
5. Installeer aanvullende pakketten voor verbeterde visualisatie.
   1. Voer uit: install.packages(c("ggprism", "colorBlindness"))
6. Installeer de aangepaste Select Spatial Spots-tool. Controleer of het besturingssysteem Windows, macOS of Linux is, en of Python versie 3.8 of hoger is geïnstalleerd. Deze stap is optioneel.
   1. Verkrijg de tool door naar de GitHub-repository te gaan (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots, bij commit hash d20946e voor reproduceerbaarheid) en de broncode te downloaden.
   2. Ga naar de directory van de tool en installeer de Python-afhankelijkheden: pip install -r requirements.txt
7. Installeer het glmGamPoi -pakket door BiocManager::install("glmGamPoi") uit te voeren om de SCTransform-normalisatie te versnellen.
   OPMERKING: De kernworkflow vereist alleen de pakketten die worden vermeld in stappen 2.1–2.3 en 2.6. Het pakket Rfast2 wordt gebruikt om de berekening van de Moran's I-statistiek te versnellen. De optionele pakketten in stap 2.5 zijn bedoeld voor het genereren van publicatiewaardige plots met een prism-stijl thema (ggprism) en voor toegang tot een kleurenblind-vriendelijk palet (colorBlindness). De tool in stap 2.6 maakt de interactieve spotselectie-functionaliteit mogelijk. Voer het commando sessionInfo() uit en sla de volledige console-output op in een tekstbestand. Hiermee worden de exacte softwareversies en pakketafhankelijkheden gedocumenteerd, wat essentieel is voor het waarborgen van de reproduceerbaarheid op lange termijn.

3. Laden van ruimtelijke gegevens en kwaliteitscontrole (1_ReadSpatialData.R, 2_SpatialDataQC.R)

1. Laad de ruimtelijke gegevens in Seurat-objecten.
   1. Gebruik Read10X_Image om handmatig de weefselafbeelding met hoge resolutie te laden, waarbij de image.dir en image.name worden gespecificeerd.
   2. Gebruik Load10X_Spatial met de image-parameter ingesteld op het afbeeldingsobject dat in stap 3.1.1 is aangemaakt om het Seurat-object te creëren.
2. Bereken kwaliteitscontrolemetrieken.
   1. Bereken het percentage mitochondriale reads met behulp van PercentageFeatureSet met het patroon ^mt-.
3. Visualiseer en interpreteer de gegevens op basis van QC-metrieken.
   1. Genereer vioolplots van nCount_Spatial, nFeature_Spatial en percent.mt met behulp van VlnPlot.
   2. Maak ruimtelijke kenmerkplots van deze metrieken met behulp van SpatialFeaturePlot om spots buiten het weefselgebied te identificeren.
      OPMERKING: Visueel controlepunt: Spots buiten het weefselgebied vertonen doorgaans lage UMI-counts (nCount_Spatial < 500) en een lage gen-detectie (nFeature_Spatial < 200)
   3. Pas voor demonstratiedoeleinden filters toe om spots van lage kwaliteit te verwijderen (bijv. subset(seurat_obj, subset = nFeature_Spatial > 200 & nCount_Spatial > 500)). Dit is een optionele stap.
      OPMERKING: Het primaire doel van QC in ruimtelijke transcriptomica is het identificeren en annoteren van technische artefacten, zoals spots buiten het weefsel. Voor de demonstratiedata van de Visium-colon worden low-complexity/achtergrondspots verwijderd met nFeature_Spatial > 200 en nCount_Spatial > 500. Inspecteer bij weefsels met een laag RNA-gehalte of gedegradeerde coupes de viool- en ruimtelijke kenmerkplots voordat drempelwaarden worden verhoogd; voor weefsels met een hoge dichtheid of hoge UMI-counts kunnen striktere drempels passend zijn. Vermijd filtering enkel op basis van hoge expressiewaarden, tenzij doubletten, weefselplooien of duidelijke artefacten zichtbaar zijn. Filtering wordt vaak niet aanbevolen, omdat het ruimtelijke locaties fysiek verwijdert, wat de continuïteit van de weefselstructuur voor downstream ruimtelijke analyse kan verstoren.

4. Voorbewerking, integratie en clustering van gegevens (3_IntegrationAndClustering.R)

1. Normaliseer en bewerk individuele monsters voor.
   1. Pas de SCTransform-normalisatie op elk monster afzonderlijk toe met assay = Spatial.
2. Integreer meerdere monsters.
   1. Bereid de lijst met SCT-genormaliseerde objecten voor integratie voor. Zorg ervoor dat elk object een "RNA"-assay heeft door de "Spatial"-assay te kopiëren: spatial_list[[1]][["RNA"]] <- spatial_list[[1]][["Spatial"]]
      ​OPMERKING: Het kopiëren van de "Spatial"-assay naar een standaard "RNA"-assay-slot dient als een noodzakelijke workaround om compatibiliteit te garanderen met downstream integratiefuncties die oorspronkelijk zijn ontworpen voor single-cell Seurat-objecten.
   2. Gebruik SelectIntegrationFeatures en PrepSCTIntegration om gedeelde variabele kenmerken te identificeren.
   3. Vind integratie-ankers met behulp van FindIntegrationAnchors met normalization.method = "SCT".
   4. Integreer de gegevens met IntegrateData met normalization.method = "SCT".
3. Voer dimensionaliteitsreductie en clustering uit op de geïntegreerde assay.
   1. Voer PCA uit op de geïntegreerde gegevens met behulp van RunPCA.
   2. Bepaal het optimale aantal hoofdcomponenten (PC's) voor downstream analyse door de cumulatieve verklaarde variantie te berekenen. Identificeer het knikpunt (elbow point) programmatisch (bijv. het punt waar de cumulatieve variantie 90% overschrijdt en de marginale winst onder 0,1% daalt), met behulp van de code in 3_IntegrationAndClustering.R, regels 36-38. Het resulterende aantal PC's wordt hierna aangeduid als pc.use.
   3. Voer RunUMAP uit met dims = 1:pc.use.
   4. Cluster de cellen met behulp van FindNeighbors met dims = 1:pc.use en FindClusters met resolution = 0.5. Pas de resolutie alleen aan na inspectie van de clusterstabiliteit en de coherentie van markergenen.
   5. Voer een differentiële expressieanalyse uit tussen doelgroepen (bijv. "B1_colon_d14" versus "A1_colon_d0") met de FindMarkers-functie.
      ​OPMERKING: Visueel controlepunt: een succesvolle integratie zal een passende menging van monsters tonen in de UMAP-plot, terwijl biologisch onderscheidende clusters behouden blijven.
4. Identificeer ruimtelijk variabele genen.
   1. Voer voor elk oorspronkelijk monster FindSpatiallyVariableFeatures uit met de "moransi"-methode op de "SCT"-assay om ruimtelijke autocorrelatie te berekenen.

5. Pre-processing van referentiedata op single-cell niveau (4_scDataPreProcessing.R)

1. Lees de single-cell RNA-seq count-matrix in met Read10X en maak een Seurat-object aan.
2. Voer standaard QC, normalisatie en clustering uit.
   1. Bereken het percentage mitochondriale reads (percent.mt) en filter de cellen (bijv. nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 7500 & percent.mt < 25).
   2. Normaliseer de data met SCTransform, waarbij vars.to.regress = "percent.mt" wordt ingesteld.
   3. Voer PCA en UMAP uit, en cluster de cellen met de methode voor dynamische PC-selectie zoals beschreven in stap 4.3.2.
3. Annoteer de celtypen.
   1. Bereken de module-scores voor canonieke celtype-markergenen met AddModuleScore.
   2. Annoteer de clusters op basis van de module-scores en bekende biologie. Importeer alternatief vooraf berekende annotaties uit metadata.

6. Referentie-gestuurde deconvolutie met SPOTlight (5_SPOTlight_Deconv.R)

1. Bereid de gegevens voor voor SPOTlight.
   1. Converteer het geannoteerde single-cell Seurat-object en het ruimtelijke Seurat-object naar SingleCellExperiment-objecten.
   2. Voer log-normalisatie uit op de single-cell-gegevens met behulp van logNormCounts.
2. Voer de SPOTlight-deconvolutie uit.
   1. Identificeer hypervariabele genen (HVG's) in de single-cell-gegevens met behulp van modelGeneVar en getTopHVGs.
   2. Bereken celtype-markergenen met behulp van scoreMarkers en filter op hoogwaardige markers (bijv. mean.AUC > 0,8).
   3. Voer downsampling uit op de single-cell-referentie voor elk celtype naar een beheersbaar aantal (bijv. 50 cellen) om de rekentijd te verkorten.
   4. Voer de deconvolutie uit met de SPOTlight functie met weight_id = "mean.AUC", group_id = "cluster", en gene_id = "gene".
3. Visualiseer en exporteer de resultaten.
   1. Extraheer de resultatenmatrix van de deconvolutie (celtype-proporties per spot).
   2. Gebruik plotSpatialScatterpie om de cellulaire compositie op de ruimtelijke coördinaten te visualiseren.
   3. Voeg de deconvolutieresultaten toe aan de metadata van het ruimtelijke Seurat-object met behulp van AddMetaData. Verwachte output: een deconvolutiematrix met kolommen voor de celtype-proporties voor elke ruimtelijke spot, ruimtelijke scatterpie-plots die de lokale cellulaire compositie tonen, en een Seurat-object waarin de deconvolutieproporties als metadata zijn opgenomen.

7. Referentievrije deconvolutie met STdeconvolve (7_STdeconvolve.R)

1. Bereid de ruimtelijke gegevens voor.
   1. Extraheer de matrix met ruwe tellingen uit het ruimtelijke Seurat-object met behulp van GetAssayData met slot = "counts".
   2. Verwijder spots en genen van lage kwaliteit met behulp van cleanCounts van STdeconvolve (bijv. min.lib.size = 100).
2. Identificeer de latente celtypen.
   1. Filter het corpus verder op genen die tot expressie komen in een minimale fractie van de spots met behulp van restrictCorpus (bijv. removeAbove=1.0, removeBelow = 0.05).
   2. Pas een Latent Dirichlet Allocation (LDA)-model toe over een reeks potentiële aantallen topics (K) (bijv. Ks = seq(2, 9, by = 1)) met behulp van fitLDA.
   3. Selecteer het optimale model op basis van de minimale perplexiteit met behulp van optimalModel met opt = "min".
3. Analyseer en visualiseer de resultaten.
   1. Extraheer de celtype- (topic) proporties (theta) en genprofielen (beta) uit het optimale model met behulp van getBetaTheta.
   2. Om de biologische interpretatie van de gedeconvolueerde topics te ondersteunen, importeert u annotaties van interessegebieden (ROI) die zijn gegenereerd door de tool "Select Spatial Spots" (zie stap 9.3.3). Gebruik deze annotaties als de parameter groups in de vizAllTopics-functie om de gedeconvolueerde celtype-proporties terug te projecteren op de ruimtelijke coördinaten en de spots per ROI te kleuren. Dit is een optionele stap.
      OPMERKING: Verwachte output: STdeconvolve moet theta-waarden teruggeven die de topic-proporties per spot vertegenwoordigen en beta-waarden die de genprofielen voor elk topic vertegenwoordigen. Indien gebruikers de unsupervised STdeconvolve-resultaten kwantitatief willen vergelijken met de referentie-gestuurde SPOTlight-outputs (uit stap 6), kunnen zij beide proportiematrices (theta van STdeconvolve en de SPOTlight-matrix) exporteren en per-spot correlatie- of concordantiemetrieken (bijv. Pearson- of Spearman-correlatie) berekenen met behulp van standaard R-functies. Kwantitatieve vergelijking tussen SPOTlight en STdeconvolve is optioneel en niet vereist voor het uitvoeren van de kernworkflow; de relevante outputmatrices zijn echter beschikbaar uit stappen 6.3.1 en 7.3.1 voor gebruikers die een dergelijke analyse willen uitvoeren.

8. Ruimtelijke cel-cel communicatie met Giotto(8_Giotto_Communication.R)

1. Converteer het Seurat-object naar een Giotto-object.
   1. Gebruik de functie createGiottoObject en voer de ruwe count-matrix en ruimtelijke coördinaten in.
2. Voorbewerking van het Giotto-object en toevoegen van de deconvolution-resultaten.
   1. Normaliseer de gegevens met behulp van normalizeGiotto.
   2. Voeg de celtype-annotaties (bijv. het hoofdceltype uit de SPOTlight-deconvolution) toe aan de celmetadata met addCellMetadata.
3. Afleiding van ruimtelijk geïnformeerde cel-celcommunicatie.
   1. Maak een ruimtelijk netwerk aan met createSpatialNetwork met method = "Delaunay" en name = "Delaunay_network".
   2. Laad een ligand-receptor-database in de R-omgeving. Zorg ervoor dat het geladen object is opgemaakt als een data frame met twee afzonderlijke kolommen die de gen-symbolen van het ligand en de receptor vertegenwoordigen (bijv. een vooraf samengesteld muisnetwerk van Zenodo: https://zenodo.org/api/records/15168114/files/lr_network_mouse.csv/content, versie v6, gepubliceerd op 7 april 2025).
   3. Voer exprCellCellcom uit met cluster_column = "celltype_major" om significante ligand-receptor-interacties te identificeren tussen celtypen die zich in ruimtelijke nabijheid bevinden. Verwachte output: een resultatentabel met ligand-receptor-paren, bron- en doelceltypecombinaties, log2 fold-change waarden en gecorrigeerde P-waarden; behoud significante interacties (bijv. p.adj < 0.05) voor visualisatie.

9. Interactieve selectie van spots met select spatial spots (6_SelectSpatialSpots.R)

1. Bereid de gegevens voor voor de interactieve tool.
   1. Extraheer de ruimtelijke coördinaten uit het Seurat-object met behulp van GetTissueCoordinates.
2. Formatteer en exporteer de gegevens.
   1. Formatteer het data frame met coördinaten zodat het de exacte kolomkoppen bevat: CELL_ID, X en Y.
   2. Exporteer het geformatteerde data frame naar een CSV-bestand.
3. Voer een analyse van het interessegebied (ROI) uit.
   1. Start de aangepaste Select Spatial Spots Dash-applicatie en laad het CSV-bestand.
   2. Selecteer interactief spots op basis van de ruimtelijke locatie.
   3. Exporteer de lijst met geselecteerde spots en hun toegewezen groep-/ROI-labels als een nieuw CSV-bestand. Verwachte output: een CSV-bestand met spot-identificatoren, X/Y-coördinaten en toegewezen groep-/ROI-labels die via CELL_ID kunnen worden gekoppeld aan het Seurat-object.

Resultaten

De implementatie van de workflow en data-integratie illustreren belangrijke weefseleigenschappen

De computationele workflow werd toegepast op ruimtelijke transcriptomics-gegevens van de muizencolon om de verwachte resultaten in de verschillende analytische fasen te illustreren. Zoals weergegeven in het schema van de workflow (Figuur 1), begon de pijplijn met data-acquisitie en kwaliteitscontrole, waarbij ruimtelijke feature-plots de weefselgrenzen afbakenden (Figuur 2A,B). Vervolgens werd de anchor-gebaseerde integratieworkflow van Seurat gebruikt om technische batch-effecten te verminderen terwijl interpreteerbare biologische variatie behouden bleef. UMAP-visualisaties toonden de uitlijning van monsters en ruimtelijke clusteringpatronen na integratie (Figuur 2C,D). De kwantitatieve, dynamische selectie van hoofdcomponenten (PC's) op basis van cumulatieve variantie werd geïmplementeerd om de dimensiereductie en downstream clustering te sturen (zie Supplementary Figure 1). Heatmap-analyse van markergenen toonde verschillende transcriptionele profielen die ten grondslag liggen aan de ruimtelijke clusters (Figuur 2E).

Om te beoordelen of de computationele clusters consistent waren met de bekende anatomische architectuur van de colonhistologie, werden de expressieprofielen van canonieke laagspecifieke markergenen geëvalueerd. De mucosale epitheellaag vertoonde expressie van epitheelcelmarkers, waaronder Epcam en Krt8, samen met de bekercelmarker Muc2. Mesenchymale en stromale markers zoals Col1a1 en Vim markeerden de lamina propria en submucosale regio's, terwijl de buitenste muscularis propria-laag werd aangewezen door gladdespier-structuurgenen zoals Acta2 en Tagln. De ruimtelijke beperking van deze lineage-geassocieerde markers ondersteunt de interpretatie dat de integratie- en clusteringworkflow de belangrijkste histologische laminaties van het colonweefsel langs de mucosa-naar-muscularis-as heeft behouden (zie Supplementary Figure 2).

Na de cluster-validatie werd een downstream differentieel expressie-analyse uitgevoerd om differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) tussen experimentele condities te identificeren (Figuur 2F,G). Bovendien werden ruimtelijk variabele genen geïdentificeerd met behulp van de Moran's I-statistiek, waarbij genen met een significante, niet-willekeurige ruimtelijke distributie over het weefsel werden geaccentueerd (Figuur 2H).

Cellulaire deconvolutie en ruimtelijke interactienetwerken onthullen weefselmicroorganisatie

Verwerking van de single-cell RNA-seq referentiedata leidde tot annotaties die werden ondersteund door QC-filtering (Figuur 3A), unsupervised clustering (Figuur 3B), validatie van markergenen (Figuur 3C) en concordantie met onafhankelijke annotaties (Figuur 3D). De cellulaire compositie (Figuur 3E) vormde de basis voor de downsampling-strategie voor deconvolutie. SPOTlight schatte de referentie-gestuurde celtype-proporties over ruimtelijke spots (Figuur 4A,B), terwijl STdeconvolve een unsupervised topic-modeling overzicht bood van ruimtelijke cellulaire patronen (Figuur 5B). De aangepaste Select Spatial Spots-tool bood histologische context voor deze patronen (Figuur 5A). Ten slotte identificeerde ruimtelijke communicatieanalyse, gebruikmakend van de gedeconvolueerde celtype-toewijzingen, ligand-receptorinteracties tussen ruimtelijk proximale celtypegroepen (Figuur 6A,B).

Probleemoplossing op basis van observaties uit protocoloptimalisatie

Tijdens de optimalisatie van het protocol werden verschillende problemen geïdentificeerd die als basis dienden voor praktische controlepunten. Suboptimale deconvolutieresultaten traden op wanneer single-cell referenties slecht aansloten bij de weefselcontext, wat aantoont dat het noodzakelijk is om weefsel- en soortspecifieke scRNA-seq data te gebruiken wanneer deze beschikbaar zijn. Initiële clusteringpogingen met standaardparameters losten niet altijd de verwachte biologische structuren op; het inspecteren van de PC-selectie, de clusteringresolutie en de coherentie van markergenen hielp bij het identificeren van ruimtelijk interpreteerbare domeinen die overeenkwamen met de weefselanatomie. Deze waarnemingen bieden praktische voorbeelden van hoe gebruikers veelvoorkomende analytische problemen kunnen diagnosticeren tijdens de uitvoering van de workflow.

Figuur 1: Workflow voor geïntegreerde ruimtelijke transcriptomanalyse. Schematische weergave van de analytische pijplijn, van data-acquisitie en pre-processing tot geavanceerde ruimtelijke analyses. De belangrijkste stappen omvatten: (1) laden van gegevens, kwaliteitscontrole en multi-sample integratie met Seurat; (2) ruimtelijke clustering en detectie van ruimtelijk variabele genen; (3) celtype-deconvolutie via referentiegebaseerde (SPOTlight) en ongesuperviseerde (STdeconvolve) methoden; (4) ruimtelijke cel-cel communicatieanalyse met Giotto en interactieve selectie van regio's van belang met behulp van een aangepaste tool, Select Spatial Spots. De resultaten van alle modules worden gesynthetiseerd om biologische inzichten in de weefselarchitectuur en de cellulaire micro-omgeving te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Dataintegratie, clustering en differentieel expressieonderzoek. (A,B) Kwaliteitscontrolemetrieken voor spatiale monsters A1 en B1, met de distributies van genaantallen, UMI-aantallen en percentages mitochondriale genen. (C) UMAP-visualisatie van geïntegreerde spatiale transcriptomics-gegevens, gekleurd op basis van monsterherkomst (links) en clusteringidentiteit (rechts). (D) Spatiale projectie van clusteridentiteiten op weefselcoupes. (E) Heatmap van de belangrijkste markergenen voor elk spatiaal cluster. (F) Volcano plot met de differentieel tot expressie gebrachte genen tussen condities A1_colon_d0 en B1_colon_d14. (G) Spatiale expressiepatronen van representatieve differentieel tot expressie gebrachte genen over weefselcoupes. (H) Spatiale expressiekaarten van de belangrijkste spatiaal variabele genen geïdentificeerd via de statistiek van Moran's I, waarbij de linker twee panelen genen van monster A1_colon_d0 tonen en de rechter twee panelen genen van monster B1_colon_d14 tonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Verwerking en annotatie van referentiegegevens op enkelcelniveau. (A) Kwaliteitscontrole-metrieken voor scRNA-seq referentiegegevens vóór en na filtering. (B) UMAP-visualisatie van scRNA-seq gegevens gekleurd op basis van ongesuperviseerde clusters. (C) Dot plot die de expressiescores van canonieke celtype-markergenen over de clusters weergeeft. (D) Geannoteerde UMAP-visualisatie van scRNA-seq gegevens met labels voor de belangrijkste celtypen. (E) Cellulaire samenstelling van de scRNA-seq referentiedataset. De rode stippellijn geeft de drempelwaarde voor downsampling (n = 50 cellen per type) aan die is toegepast tijdens de SPOTlight-deconvolutie om een balans te vinden tussen computationele efficiëntie en de representatie van celtypen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Ruimtelijke deconvolutie van cellulaire heterogeniteit. (A,B) Ruimtelijke scatterpie-plots van de SPOTlight-deconvolutie die de proportionele samenstelling van de belangrijkste celtypen per spot tonen voor monsters A1 (A) en B1 (B). (C) Representatieve ruimtelijke distributie van B-cellen in monsters A1 (links) en B1 (rechts), die de ruimtelijk opgeloste lokalisatiepatronen van een specifieke immuuncelpopulatie demonstreert die via deconvolutie is geïdentificeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Interactieve analyse van interessegebieden en vergelijking van ongesuperviseerde deconvolution. (A) Interface van de aangepaste tool "Select Spatial Spots" waarin de interactieve selectie van regio's wordt getoond die overeenkomen met proximale colon, distale colon en andere weefseldomeinen. (B) Ruimtelijke scatterpie-visualisatie van de resultaten van ongesuperviseerde deconvolution (STdeconvolve) voor monster A1, waarbij de spots zijn gekleurd volgens de handmatig geannoteerde regio's uit (A), wat de overeenkomst illustreert tussen de op histologie gebaseerde annotatie en de computationeel afgeleide cel-topicdistributies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Ruimtelijk geïnformeerde cel-cel-communicatienetwerken. (A,B) Ligand-receptor-interactienetwerken afgeleid door Giotto voor monsters A1 (A) en B1 (B). Knopen vertegenwoordigen celtypen, randen vertegenwoordigen significante ligand-receptorparen (FDR < 0.05), en de lijndikte komt overeen met de interactiesterkte. Om vergelijkbaarheid en visuele helderheid te waarborgen, is een uniforme significantiedrempel (FDR < 0.05) toegepast op alle monsters, en worden de top 20 interacties gerangschikt op log2FC weergegeven voor elke conditie. De netwerken benadrukken celtype-specifieke communicatiepatronen binnen de ruimtelijke context van colonweefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Kwantitatieve evaluatie van parameteroptimalisatie voor dimensionaliteitsreductie. De elbow-plot demonstreert de programmatische aanpak van de workflow voor het dynamisch selecteren van het optimale aantal hoofdcomponenten (PCs). De selectie wordt berekend op basis van cumulatieve standaarddeviatie en drempelwaarden voor marginale variantie, weergegeven door de rode verticale lijn, om biologische variantie vast te leggen terwijl technische ruis vóór downstream clustering wordt beperkt.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: Validatie van ruimtelijke clustering met behulp van canonieke markers specifiek voor de colonlagen. (A) Dot plot die de verrijkte expressie van epitheliale, stromale en gladde spier markers weergeeft over de computationele clusters. (B) Ruimtelijke feature plots die representatieve markers (Epcam, Col1a1, Acta2) terugkoppelen naar de weefselcoördinaten.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Dit protocol biedt een uitgebreide computationele workflow voor de analyse van ruimtelijke transcriptomica-gegevens die een balans biedt tussen analytische diepgang en praktische toegankelijkheid. De stapsgewijze aanpak begeleidt onderzoekers door de volledige analytische pijplijn, van de initiële gegevensverwerving tot geavanceerde ruimtelijke analyses, waarbij de nadruk ligt op kritieke beslismomenten en potentiële valkuilen.

Verschillende stappen in het protocol verdienen bijzondere aandacht vanwege hun impact op de vervolganalyses. De drempelwaarden voor kwaliteitscontrole en filtering moeten zorgvuldig worden afgestemd op specifieke weefseltypes en technologieplatforms, aangezien te strikte filtering biologisch relevante spots kan verwijderen, terwijl te lakse drempelwaarden technische ruis kunnen introduceren. De keuze van de normalisatiemethode beïnvloedt de resultaten van de clustering en differentiële expressie aanzienlijk. Zo maakt de pipeline gebruik van SCTransform in plaats van standaard log-normalisatie, omdat is gerapporteerd dat SCTransform technische variatie gerelateerd aan sequencing-diepte en andere technische effecten in single-cell en ruimtelijke workflows beter modelleert en reduceert^14,15. Tijdens de integratie vereist de selectie van integratiekenmerken en resolutieparameters een zorgvuldige afweging om de integratiesterkte in balans te brengen met het behoud van het biologische signaal. Voor het identificeren van ruimtelijk variabele genen is Moran's I gekozen vanwege de computationele schaalbaarheid en geschiktheid voor ruimtelijke autocorrelatieanalyse in array-gebaseerde data, hoewel alternatieve methoden zoals SPARK overwogen kunnen worden, afhankelijk van de omvang van de dataset en de doelstellingen van het onderzoek¹⁶.

Het onderdeel voor probleemoplossing van deze workflow richt zich op veelvoorkomende interoperabiliteitsproblemen die optreden bij het doorgeven van resultaten van het ene pakket naar het volgende. In plaats van te vertrouwen op één enkele generieke conversiestap, maakt de workflow gebruik van aangepaste formaatconversies bij elke software-interface: ruimtelijke telgegevens worden gekopieerd naar een standaard RNA-assay-slot vóór de Seurat-integratie; Seurat- en single-cell referentie-objecten worden omgezet in SingleCellExperiment-objecten voor SPOTlight; ruimtelijke telmatrices worden geherformateerd voor STdeconvolve; Seurat-afgeleide tellingen, coördinaten en celtype-metadata worden omgezet in een Giotto-object voor analyse van cel-celcommunicatie; en ROI-annotaties van Select Spatial Spots worden geëxporteerd als CSV-bestanden met CELL_ID, X/Y-coördinaten en groeplabels, zodat ze kunnen worden teruggekoppeld naar het Seurat-object. Deze stappen helpen gebruikers bij het identificeren en corrigeren van veelvoorkomende problemen, zoals incompatibele assay-slots, niet overeenstemmende spot-identificatoren, ontbrekende metadatacolommen, incorrecte coördinaatnotatie en mismatches in gen-symbolen voor ligand-receptorinteracties.

Een aanvullend kenmerk van deze workflow is het gebruik van twee complementaire deconvolutie-strategieën in plaats van de afhankelijkheid van één enkel algoritme. SPOTlight maakt gebruik van eerdere scRNA-seq referenties voor referentiegestuurde schatting van celtype-proporties, terwijl STdeconvolve referentievrije ontdekking van latente transcriptionele topics mogelijk maakt. In de demonstratieset kwamen STdeconvolve-topics overeen met histologisch gedefinieerde regio's (Figuur 5B), wat de biologische interpreteerbaarheid ondersteunt. Een directe kwantitatieve vergelijking tussen de twee methoden is in dit protocol niet uitgevoerd; gebruikers die deze op hun eigen data willen benchmarken, kunnen het kader volgen dat is beschreven in protocolstap 7.3.2. Bovendien ondersteunt het protocol de bruikbaarheid en traceerbaarheid door scripts te gebruiken voor kernfuncties, terwijl er een grafische interface (Select Spatial Spots) wordt aangeboden voor intuïtieve ROI-isolatie.

Door Seurat en Giotto te koppelen, kan de workflow Seurat-gebaseerde pre-processing en integratie combineren met Giotto-gebaseerde ruimtelijke statistiek en netwerkanalyse. Seurat biedt een gevestigde omgeving voor onderzoekers met ervaring in scRNA-seq en ondersteunt integratie van meerdere monsters, terwijl het overdragen van de geharmoniseerde gegevens naar Giotto de constructie van ruimtelijke netwerken en ligand-receptoranalyse mogelijk maakt. Dit ontwerp stelt gebruikers in staat om de gedocumenteerde sterke punten van beide platforms te benutten, zonder te impliceren dat ze hier zijn gebenchmarkt ten opzichte van Squidpy of andere frameworks. Voor cel-celcommunicatie is de op Delaunay-netwerken gebaseerde ligand-receptorinferentie van Giotto gebruikt, omdat deze ruimtelijke nabijheid integreert binnen dezelfde analyseomgeving; frameworks zoals CellChat bieden uitgebreide signaleringsdatabases, maar worden in dit protocol niet geëvalueerd¹⁷.

Er moet rekening worden gehouden met enkele beperkingen. De referentiegebaseerde deconvolutiebenadering is kritisch afhankelijk van de beschikbaarheid van hoogwaardige, overeenkomstige single-cell referenties. Bovendien rusten de fundamentele aannames achter de analyse van cel-celcommunicatie op transcript-co-expressie als proxy voor fysieke eiwitinteractie, wat een daaropvolgende experimentele validatie vereist. Ten slotte is deze workflow primair ontwikkeld voor standaard Visium-datasets. Naarmate het vakgebied vordert richting technologieën met een resolutie die dicht bij single-cell ligt, zoals Visium HD, zullen de analytische overwegingen verschuiven; data met een hogere resolutie kunnen andere parameters voor voorbewerking vereisen en de absolute noodzaak voor spot-deconvolutie verminderen. Om deze workflow aan te passen voor Visium HD-datasets kunnen de bins met hoge resolutie computationeel worden samengevoegd tot grotere ruimtelijke bins, of kunnen spot-deconvolutiemodules worden overgeslagen ten gunste van beeldgebaseerde celsegmentatie¹⁸.

Deze kenmerken suggereren een potentiële toepasbaarheid over diverse biologische domeinen, waaronder ontwikkelingsbiologie, neurowetenschappen, kankeronderzoek en immunologie^19,20,21,22. Het modulaire ontwerp stelt onderzoekers in staat om specifieke componenten aan te passen aan hun behoeften, of de focus nu ligt op de identificatie van ruimtelijke domeinen, cellulaire communicatie of regionale specialisatie. Naarmate ruimtelijke technologieën zich blijven ontwikkelen en datasets uitbreiden, biedt dit protocol een basis die kan worden uitgebreid om nieuwe analytische methoden te integreren en opkomende biologische vragen te beantwoorden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
ggplot2	Posit Software, PBC	v4.0.0(CRAN)	Geavanceerde datavisualisatie
Giotto	Dries Lab	v4.2.2 (GitHub)	Analyse van ruimtelijke netwerken en cel-cel communicatie
patchwork	Thomas Lin Pedersen	v1.3.2 (CRAN)	Compositie en ordening van plots
R software	R Foundation for Statistical Computing	v4.4.3	Kernuitvoeringsomgeving (macOS aarch64)
scater	Davis McCarthy et al.	v1.34.1 (Bioconductor)	Kwaliteitscontrole en visualisatie van single-cell data
scran	Aaron Lun et al.	v1.34.0 (Bioconductor)	Single-cell variantiemodellering en markerdetectie
Select Spatial Spots (Aangepaste Python-tool)	LeafLight	v1.0.0 (GitHub)	Interactieve selectie van ruimtelijke regio's van belang (ROI) (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots)
Seurat	Satija Lab	v5.3.0 (CRAN)	Preprocessing, integratie en clustering van ruimtelijke data
SeuratObject	Satija Lab	v5.2.0 (CRAN)	Datastructuren voor single-cell en ruimtelijke data
SingleCellExperiment	Bioconductor Core Team	v1.28.1 (Bioconductor)	Gestandaardiseerde datacontainer voor scRNA-seq
SPOTlight	Marc Elosua-Bayes et al.	v1.10.0 (Bioconductor)	Referentie-gestuurde ruimtelijke deconvolutie
Stdeconvolve	Jean Fan Lab	v1.3.2 (Bioconductor)	Ongecontroleerde latente topic-modellering
tidyverse	Posit Software, PBC	v2.0.0 (CRAN)	Kernsuite voor datamanipulatie en opmaak