Onderzoeksartikel
Polygonale gating (PGG) en kruisvormige gating (CFG) zijn flowcytometriemethoden om de integriteit van sperma-DNA te detecteren. PGG meet de DNA-fragmentatieindex (DFI) en de hoge DNA-kleuringsindex (HDS). CFG meldt ernstige DFI, milde DFI en algemene DFI. Deze studie heeft als doel de resultaten en correlaties tussen deze te vergelijken.
De integriteit van sperma-DNA is een belangrijke factor voor succesvolle bevruchting, embryoontwikkeling en voortdurende zwangerschap. Spermachromatinestructuurbeoordeling (SCSA) met behulp van flowcytometrie na DNA-denaturatie en acridine-oranjekleuring wordt beschouwd als de gouden standaard voor het evalueren van spermad-DNA. Twee gatingstrategieën voor op flow cytometrie gebaseerde beoordeling van de sperma DNA-fragmentatieindex (DFI) zijn in de literatuur gerapporteerd: polygonale gating (PGG) en kruisvormige gating (CFG). Het doel van deze studie was het vergelijken van de relaties van assayresultaten tussen PGG en CFG, en hun correlaties met parameters van basiszaadanalyse te analyseren. Gegevens die onafhankelijk van elkaar werden verkregen met de twee methoden werden vergeleken met statistische analyse, waaronder Bland-Altman-grafieken en regressieanalyse. In totaal werden 121 mannelijke poliklinische patiënten geselecteerd die een vruchtbaarheidsbeoordeling ondergingen in het voortplantingscentrum van ons ziekenhuis via een volledig willekeurige steekproefmethode. Sperma DFI en gerelateerde indicatoren werden gedetecteerd door flowcytometrie met respectievelijk PGG en CFG. De resultaten toonden aan dat DFI-waarden verkregen uit de twee methoden goede overeenstemming vertoonden. De correlatiecoëfficiënten tussen DFIp uit de PGG-methode en DFIm, DFIs en DFIc uit de CFG-methode waren respectievelijk 0,6497, 0,9404 en 0,9667 (allemaal p < 0,01). Een hoge DNA-kleuringsindex (HDS) liet een lichte negatieve correlatie zien met DFI's (r = -0,3042, p < 0,05). Het percentage progressief beweeglijk zaadcellen was negatief gecorreleerd met DFIp, DFIs en DFIc (r = respectievelijk -0,3824, -0,3794, -0,3574, allemaal p < 0,05). Er werd geen significante correlatie waargenomen tussen HDS en spermavolume, spermaconcentratie, totale zaadcelaantal, of PR (%). Deze bevindingen geven aan dat DFI's nauwer geassocieerd zijn met mannelijke vruchtbaarheid, wat suggereert dat de CFG-methode, die deze parameter biedt, geschikter kan zijn voor klinische beoordeling van sperma-DNA-schade.
De integriteit van sperma-DNA verwijst naar de integriteit en functionele stabiliteit van de DNA-moleculaire structuur in de zaadcelkern. Specifiek wordt het gekenmerkt door normale chromatineconformatie, intacte basensequenties zonder breuk of oxidatieve schade, en het vermogen om genetische informatie nauwkeurig over te dragen aan nakomelingen. Tijdens spermatogenese, wanneer oxidatieve stresstoeneemt 1, chromatine-remodellering abnormaal is2, of het sperma wordt beïnvloed door omgevingstoxines3, wordt de integriteit van sperma-DNA beschadigd, wat resulteert in basismismatch, verlies, modificatie, DNA-toevoeging en kruisverbinding, enkelstrengs en dubbelstrengs breuken, enzovoort. Bovendien kan beschadigd sperma-DNA de mannelijke vruchtbaarheid aantasten en de uitkomsten van zwangerschap in geassisteerde voortplantingstechnologie (ART)4 nadelig beïnvloeden, terwijl het ook het risico op terugkerend zwangerschapsverlies verhoogt5. In 2021 adviseerde de European Association of Urology (EAU) de opname van DFI-testen in het mannelijke vruchtbaarheidsbeoordelingssysteem6.
Op dit moment wordt de integriteit van sperma-DNA voornamelijk geëvalueerd door het detecteren van de sperma DNA-fragmentatieindex (DFI). De spermchromatinestructuurtest (SCSA) door flowcytometrie is de primaire methode voor het beoordelen van DFI7. Twee flowcytometrie-poortmethoden voor het opsporen van sperma DFI zijn in de literatuur gerapporteerd. Eén daarvan is de polygonale gatingmethode (PGG), die gelijktijdig twee belangrijke indicatoren kan rapporteren, zoals sperma DFI en HDS8. PGG is een klassieke SCSA-benadering die wordt gekenmerkt door een kleinere detectiecoëfficiënt van variatie en superieure herhaalbaarheid9. Het kan echter niet de ernst van DNA-schade onderscheiden. Een ander type is de kruisvormige gatingmethode (CFG), die ernstige schademarker van spermad-DNA (DFI's), milde schademarker van sperma-DNA (DFIm) en de totale DFI van de kruisvormige gatingmethode (DFIc) kan rapporteren. DFIc is gelijk aan de som van DFI's en DFIm. In vergelijking met huidige technologieën voor het beoordelen van de integriteit van sperma-DNA kan de CFG-methode de ernst van sperma-DNA-schade weerspiegelen10.
Om te bepalen welke methode het meest geschikt is voor het beoordelen van de spermakwaliteit, gebruikte deze studie zowel de PGG-methode als de CFG-methode om DFI en gerelateerde parameters in sperma te meten. De correlatie tussen de resultaten van deze twee methoden en conventionele spermaanalyseparameters werd vergeleken. Voor zover wij weten is dit de eerste studie die de correlatie van detectieresultaten tussen de twee methodologieën, PGG en CFG, analyseert.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Deze studie werd goedgekeurd door de Medische Ethiek Commissie van het Affilieerde Huai'an First People's Hospital van de Nanjing Medische Universiteit (goedkeuringsnummer: KY-2024-181-01). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten van wie de monsters in deze studie werden gebruikt. Algemeen schematisch diagram van de workflow weergegeven in Figuur 1. De details van de gebruikte reagentia en apparatuur zijn weergegeven in de Materiaaltabel.
Instellingen van CFG voor de flowcytometer
Na zuurbehandeling vertoont het nucleaire chromatine van sperma met beschadigd DNA enkelstrengs DNA, terwijl het nucleaire chromatine van sperma met onbeschadigd DNA zijn intacte dubbelstrengige structuur behoudt. De fluorescerende kleurstof acridijnoranje (AO) bindt aan enkelstrengs DNA en zendt rode fluorescentie uit wanneer deze wordt geëxciteerd door een 488 nm laser. Wanneer het gebonden is aan dubbelstrengs DNA, zendt het groene fluorescentie uit wanneer het wordt geëxciteerd door een 488 nm laser. Op basis van het aantal rode en groene fluorescerende signalen dat door de flowcytometer wordt opgevangen, wordt de verhouding van rode fluorescentie tot het totaal van rode en groene fluorescentie berekend, wat de sperma DFI vertegenwoordigt.
De CFG-instellingen zijn geïmplementeerd volgens het overzicht van Yang et al.10. De flowcytometer moet worden geconfigureerd met de laagste groene fluorescentie en de hoogste rode fluorescentie gemeten in AO-gekleurde normale sperma als grensreferenties (Figuur 2). Hieronder volgt een lijst van de cellulaire kenmerken van elk kwadrant in de CFG:
Kwadrant Q1 wijst op normaal sperma. Er werd waargenomen dat het sperma-DNA intact was en dat de bindingshoeveelheid AO minimaal was, wat resulteerde in groene fluorescentie.
Sperma in kwadrant Q2 hebben gedeeltelijk gefragmenteerd DNA en lijken oranje onder fluorescentiemicroscopie. Dergelijk DNA kan herstelbaar zijn, deze sperma worden geclassificeerd als met milde DNA-fragmentatie (DFIm)10.
Kwadrant Q3 wordt gedefinieerd als de niet-specifieke fluorescentie die subtractie heeft ondergaan.
Sperma in kwadrant Q4 hebben gefragmenteerd DNA en lijken rood onder fluorescentiemicroscopie, wat wijst op ernstige DNA-fragmentatie (DFI's).
Er wordt voorgesteld dat zaadcellen in kwadranten Q2 en Q4 beide gefragmenteerd DNA bevatten, en hun som wordt gedefinieerd als DFIc.
Instellingen van de PGG voor de flowcytometer
De polygonale poort voor flowcytometrische analyse werd vastgesteld volgens de methode beschreven door Evenson et al.8. Zoals weergegeven in Figuur 3, zijn de cellulaire kenmerken die met elke poort zijn geassocieerd als volgt:
P3 geeft het percentage cellen met gedenatureerd DNA aan.
P4 vertegenwoordigt sperma met een hoge DNA-kleurbaarheid (HDS). Deze groep sperma mist de normale histone-protamine uitwisseling.
De overheersende celpopulaties buiten de P3- en P4-poorten bestaan uit normale spermatozoa, die verminderde rode fluorescentie vertonen en overwegend groene fluorescentie uitzenden.
Spermamonsterverzameling en analyse
Alle 121 spermamonsters waren afkomstig van de mannen die het Reproductiecentrum van het Huai'an First Hospital bezochten, verbonden aan de Nanjing Medical University. Spermamonsters werden verzameld door te masturberen na een periode van 2-7 dagen onthouding. Routinematige spermaanalyse werd strikt uitgevoerd volgens de eisen van het WHO Laboratoriumhandboek voor het Onderzoek en Verwerken van Menselijk Sperma11,12. Spermaconcentratie- en motiliteitsanalyses werden uitgevoerd met behulp van een computerondersteund spermaanalysesysteem (CASA). Elk monster werd twee keer geanalyseerd. De resultaten werden alleen als het gemiddelde gerapporteerd wanneer het verschil tussen de twee resultaten binnen het 95% betrouwbaarheidsinterval lag; verder werden herbemonstering en analyse uitgevoerd.
DFI-analyse
Bereken het benodigde monstervolume voor het spermamonster zodat de uiteindelijke concentratie zaadcellen in reagens A uit de flowcytometriekit 2–3 x 106/mL is. Berekeningsmethode: Uitgaande van de zaadconcentratie in het oorspronkelijke spermamonster is M x 106/mL, dan is het vereiste spermavolume (μL) = 150/M. Voeg het berekende spermavolume toe aan een flowcytometerbuis, voeg vervolgens 50 μL reagens A toe en meng voorzichtig. Voeg 100 μL reagens B toe, meng voorzichtig en incubeer 30 seconden bij kamertemperatuur. Voeg onmiddellijk 300 μL reagens C toe en meng voorzichtig. Detecteer het monster met CFG en PGG op de flowcytometer en analyseer minstens 5000 spermatozoa.
Statistische analyse
De gegevens werden statistisch geanalyseerd met behulp van GraphPad Prism 6.0. Bland-Altman-grafieken werden opgesteld om het niveau van overeenstemming tussen PGG en CFG te beoordelen door het gemiddelde en de verschillen te berekenen. De verschillen tussen de twee methoden werden uitgezet tegen hun gemiddelde waarden. Bovendien werd de Pearson-methode gebruikt om de correlatie tussen PGG en CFG te analyseren. Er werd vastgesteld dat een p-waarde kleiner dan 0,05 statistisch significant was.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Van de 121 deelnemers (gemiddelde leeftijd: 32,5 ± 4,9 jaar; bereik: 26–44 jaar) kregen 28 de diagnose asthenozoospermie en 4 oligozoospermie. Basisdemografische kenmerken en spermaanalyseparameters worden samengevat in Tabel 1.
Zoals aangetoond in Figuur 4, toonde de Bland-Altman-grafiek aan dat de sperma DFI-resultaten verkregen met de PGG- en CFG-methoden uitstekende consistentie vertoonden (r = 0,9667, p = 0,0...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De zesde editie van het WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen12 beveelt vier methoden aan om de integriteit van sperma-DNA te beoordelen: terminale deoxynucleotidyltransferase (dUTP) nick end labelling (TUNEL), single cell gel elektroforese (Comet) assays, SCSA en sperma chromatine dispersie (SCD) test. Onder deze is SCSA breed toegepast in andrologielaboratoria vanwege het gebruik van flowcytometrie voor analyse, wat hoge doorvoe...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hebben niets te onthullen.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Computer-assisted sperm analysis system | Beijing Suijia Software Co., Ltd | SA-II | |
| Flow cytometer | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | Cyto E6 | |
| Flow cytometry kit | Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD | ||
| Makler counting chamber | Sefi Medical Instruments | ||
| Sperm nucleus DNA integrity Kit | Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD | - |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen