Een digitaal microfluïdisch elektroporatieplatform voor low-input CRISPR-genoombewerking en mRNA-transfectie in suspensie-T-cellen en 3D-celmodellen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft miniaturiseerde CRISPR–Cas9 genoombewerking van de TCRα/β receptor in primaire menselijke T-cellen met behulp van 'DMF-ection', een digitaal microfluïdisch (DMF) elektroporatieplatform. De methode maakt parallelle, laag-input genbewerking met hoge levensvatbaarheid mogelijk en is verder aanpasbaar voor mRNA-levering in meercellige 3D-sferoïden.

Samenvatting

Digitale microfluidische (DMF) elektroporatie maakt precieze, laag-volume genetische manipulatie van zoogdiercellen mogelijk, terwijl cellulaire input tot 100x wordt geminimaliseerd en de levensvatbaarheid behouden blijft. Deze studie presenteert een high-throughput DMF-gebaseerde transfectieworkflow voor CRISPR-gemedieerde knockout van de TRAC-locus in primaire menselijke suspensie-T-cellen en voor mRNA-transfectie van driedimensionale HEK293T sferoïden. Met ruimtelijk afgezet CRISPR-gids-RNA's en on-cartridge ribonucleoproteïne (RNP) assemblage werd efficiënte TRAC-locusverstoring bereikt in zowel CD4⁺- als CD8⁺ T-celpopulaties met slechts 10.000 cellen per conditie, met post-editing levensvatbaarheid van meer dan 85%. Biofysische karakterisering met behulp van flow-geïnduceerde en Taylor-dispersieanalyses toonde aan dat polymeeradditieven Cas9–sgRNA-complexen stabiliseren onder elektroporatiebuffercondities, wat reproduceerbare bewerking ondersteunt bij submicrolitervolumes. De workflow werd verder aangepast voor 3D-toepassingen door EGFP mRNA in intacte HEK293T sferoïden te brengen, wat resulteerde in robuuste en ruimtelijk uniforme fluorescentie zonder de groei of morfologie van de sferoiden te belemmeren. Samen tonen deze resultaten aan dat DMF-elektroporatie efficiënte genoombewerking en mRNA-levering mogelijk maakt over zowel suspensie-immuuncellen als meercellige sferoïden. Dit platform biedt een schaalbare en laag-input oplossing voor toepassingen in CAR-T celtherapie, functionele genomica en geavanceerde 3D-cellulaire modellen.

Inleiding

Genbewerking in primaire menselijke cellen wordt steeds belangrijker voor zowel therapeutische ontwikkeling als fundamenteel onderzoek, inclusief toepassingen in immuno-engineering, modellering van zeldzame ziekten en functionele genomica¹. Hoewel elektroporatie zeer efficiënte genoombewerking mogelijk maakt, vereisen conventionele cuvet-gebaseerde systemen doorgaans tot miljoenen cellen per conditie, waardoor hun gebruik voor door patiënten afgeleide monsters en zeldzame immuunpopulaties beperkt^{wordt 2}. Bovendien zijn deze systemen slecht geschikt voor grootschalige screening vanwege beperkingen in doorvoer, automatisering en reagensverbruik³.

Microfluidische elektroporatie is naar voren gekomen als een veelbelovende benadering voor low-input genoombewerking⁴. De meeste bestaande platforms vertrouwen echter op continue stromingsarchitecturen die complexe vloeistofhantering, beperkte flexibiliteit bij het mengen van reagentia en relatief hoge celvereisten per conditie vereisen. Daarentegen maakt digitale microfluidica (DMF) actieve manipulatie mogelijk van discrete druppels op nanoliterschaal op een vlakke elektrodearray, wat precieze controle mogelijk maakt over de samenstelling, timing en ruimtelijke lokalisatie van reacties. Dit plug-and-play druppelgebaseerde formaat is zeer geschikt voor laagvolume, hoogdoorvoerwerk, waarbij behoud van primaire cellen en reagentia essentieel is⁵.

Recent werk heeft de haalbaarheid aangetoond van DMF-gebaseerde intracellulaire levering met tri-druppel elektroporatie-architecturen die gelokaliseerde, laagstroom-elektrische velden genereren voor efficiënte RNP- en mRNA-levering, terwijl thermische en elektrochemische stress ^6,7,8 worden geminimaliseerd. Voortbouwend op deze basis werd een volgende generatie DMF-elektroporatieplatform ontwikkeld, genaamd 'DMF-ection', met 48 onafhankelijk adresseerbare reactieplaatsen, volledige automatiseringscompatibiliteit en schaalbare cartridgeproductie⁹ (Figuur 1). De DMF-cartridge bestaat uit een onderste PCB-plaat en een plastic bovenplaat, gescheiden door een pakking, die via uitlijnsnaps in één correcte oriëntatie worden gemonteerd (Figuur 1A). De 48-plex indeling is georganiseerd in acht identieke families (Figuur 1A–H), elk met zes onafhankelijk adresseerbare elektroporatieplaatsen, die tot 48 parallelle bewerkingscondities per cartridge ondersteunen (Figuur 1B). Gids-RNA-bibliotheken worden op het substraatoppervlak aangebracht met behulp van een akoestische dispenser voorafgaand aan de montage van de cartridge. De positionele nauwkeurigheid van depositie werd bevestigd op alle 48 locaties, waarbij dropposities binnen submillimeterafwijking van het elektrodemiddenpunt clusterden (Figuur 1C), wat een betrouwbare RNP-assemblage op de cartridge ondersteunt. Na het laden worden cellen en vloeibare elektrodedruppels op de cartridge geactiveerd om de tri-druppel elektroporatiegeometrie te vormen (Figuur 1D). Na elektroporatie worden cellen afgeladen in kweekplaten voor herstel en downstream analyse, inclusief flowcytometrie, sequencing en microscopie (Figuur 1E). Dit systeem maakt hoogefficiënte genoombewerking mogelijk met tot 100 keer minder cellen dan standaard cuvette-gebaseerde methoden, waardoor de toegang tot genoomengineering in toepassingen met lage input en hoge doorvoer aanzienlijk wordt uitgebreid.

Deze studie beoordeelt de prestaties van het platform door meerdere biomoleculaire ladingen af te leveren, waaronder mRNA en CRISPR–Cas9 ribonucleoproteïne (RNP) complexen, wat efficiënte transfectie en genverstoring bereikt. Naast primaire T-cellen biedt DMF-ection een generaliseerbaar kader voor het afleveren van nucleïnezuren in complexe meercellige structuren. Driedimensionale (3D) sferoïden en organoïde-type modellen vormen aanzienlijke barrières voor de penetratie van reagens vanwege hun architectuur en kwetsbaarheid, en conventionele elektroporatiemethoden verstoren vaak de morfologie of zorgen voor heterogene levering. Om te beoordelen of dezelfde miniaturiseerde elektroporatieprincipes die voor T-celbewerking worden gebruikt, ook gelden voor gestructureerde weefsels, werd de DMF-workflow toegepast op 3D-HEK293T sferoïden. Deze experimenten toonden aan dat DMF-gebaseerde elektrowetting intacte sferoïden voorzichtig binnen tri-druppelgeometrieën kan positioneren en een uniforme mRNA-afgifte ondersteunt, terwijl structuur en groei behouden blijven. Hoewel deze resultaten buiten het hier beschreven primaire T-celprotocol vallen, illustreren ze de bredere toepasbaarheid van programmeerbare DMF-elektroporatie voor opkomende 3D-cellulaire systemen die relevant zijn voor geneesmiddelenontdekking en ziektemodellering.

Protocol

De primaire menselijke T-cellen die in dit protocol worden gebruikt, zijn verkregen van commerciële leveranciers met geïnformeerde donortoestemming en in overeenstemming met toepasselijke institutionele, ethische en regelgevende richtlijnen. Alle omgang met biologisch materiaal van mensgemaakte basis vond plaats volgens institutionele bioveiligheidsprotocollen. Onderzoekers die dit protocol implementeren, zijn verantwoordelijk voor het waarborgen dat hun gebruik van primaire menselijke cellen voldoet aan de eisen van de lokale institutionele beoordelingscommissie (IRB) of ethische commissie, de toepasselijke bioveiligheidsvoorschriften en eventuele relevante nationale of regionale wetgeving die het gebruik van menselijk biologisch materiaal regelt. Er was geen patiënt-identificeerbare informatie gekoppeld aan het celmateriaal dat in deze studie werd gebruikt.

1. Voorbereiding en activatie van primaire menselijke T-cellen

1. Ontdooi snel primaire menselijke CD3⁺ T-cellen in een waterbad van 37 °C. De cellen worden overgebracht naar voorverwarmde basale T-cel en centrifugeren op 180 × g gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg en suspendeer de pellet opnieuw in een nieuw medium.
2. Bepaal de celconcentratie en levensvatbaarheid met behulp van een geautomatiseerde celteller.
3. Susselt cellen bij 1 × 10^{6 cellen} /mL in een T-cel kweekmedium, aangevuld met een oplosbaar tetramere antilichaam CD3/CD28 T-cel activatorstimulus (volgens de instructies van de leverancier) en 200 IU/mL IL-2. Incubeer cellen 72 uur bij 37 °C, 5% CO₂.
   OPMERKING: Houd de celdichtheid tussen 0,5–2 × 10^{6 cellen} /mL tijdens activatie. Voer activatie uit in U-bodemplaten met 96 putten om het contact van cel tot activator en activatie-efficiëntie te optimaliseren.

2. Voorbereiding van geleidings-RNA-vlekken op het DMF-substraat (akoestische dispenserspotting)

1. Reconstrueren van gelyofilieerd sgRNA in nucleasevrij water tot een lagerconcentratie van 100 μM. In een aparte buis bereid je een voorraad van 100 mg/mL poly-L-glutaminezuur (PGA, natriumzout, MW 15.000–50.000 Da) in nucleasevrij water. Combineer sgRNA- en PGA-voorraad met een volumeverhouding van 5:4 (sgRNA: PGA), wat resulteert in een uiteindelijke sgRNA-concentratie van 55,6 pmol/μL en een uiteindelijke PGA-concentratie van 44,4 mg/mL in nucleasevrij water. Vortex kort en centrifugeer bij 1.000 × g gedurende 30 seconden, aliquot in wegwerpvolumes en slaat ongebruikte aliquots op bij −80 °C tot 6 maanden.
   OPMERKING: Vermijd herhaalde vries-dooicycli.
2. Voeg het geleider-PGA-mengsel toe aan een akoestische bron met laag dode volume in putten die overeenkomen met de gewenste indeling van de reactieplaats.
3. Breng 40 nL (gelijk aan 2,2 pmol sgRNA) van het guide-PGA-mengsel over naar elk doelgebied van het DMF-substraat met behulp van een gekalibreerde akoestische dispenser.
   OPMERKING: Bij 55,6 pmol/μL levert 40 nL 2,2 pmol sgRNA per site (55,6 × 0,040 = 2,22 pmol). Gedroogde geleiders worden opnieuw samengesteld tijdens het samenvoegen van druppels op de cartridge; volledige herophanging wordt bevestigd door consistente bewerkingsefficiëntie over verschillende sites.
4. In een biologische veiligheidskast laat je de gevlekte druppels volledig aan de lucht drogen op kamertemperatuur totdat er geen zichtbare vloeistof meer over is (ongeveer 5 minuten).
   OPMERKING: Gebruik geen geforceerde luchtstroom of warmte, omdat dit het geleide-RNA kan losmaken of degraderen.
5. Zet de DMF-cartridge in elkaar.
   1. In een biologische veiligheidskast richt je de bovenste plaat uit op het gevlekte substraat door de asymmetrische plastic snap-elementen van de bovenplaat te laten afstemmen met de inkepingen op de onderplaat. Oefen gelijkmatige, gelijktijdige druk uit langs de korte randen totdat een duidelijk mechanisch klikje wordt gevoeld, waarmee de vergrendelingsfuncties volledig worden vastgegrepen.
      OPMERKING: De cartridge is ontworpen met één correcte oriëntatie; Verkeerde montage veroorzaakt de snap niet. Houd substraten altijd bij de randen om besmetting of schade aan functionele oppervlakken te voorkomen en om te voorkomen dat de substraten tegen elkaar schuiven, omdat dit de oppervlaktecoatings kan bekrassen.
   2. Checkpoint: Bevestig de juiste montage met de mechanische drukknop.
      OPMERKING: Er is geen prerun elektrische indicator van coatingintegriteit; eventuele functionele storingen als gevolg van onjuiste assemblage worden automatisch gedetecteerd en gerapporteerd in het QC-rapport na uitvoering.
      Pauzepunt: Bewaar ongebruikte gemonteerde patronen in een verzegelde verpakking met droogmiddel (silicagelzakjes) tot 48 uur op kamertemperatuur.

3. Celvoorbereiding

1. Bereid voor elk gebruik 1 mL Complete Transfection Buffer voor door de DMF-compatibele elektroporatiebuffer te combineren met de meegeleverde biocompatibele niet-ionische tenside in een verhouding van 20:1 (v/v) (elektroporatiebuffer: tenside), wat resulteert in een uiteindelijke oppervlakteactieve concentratie van 0,05% (v/v). Meng voorzichtig en laat het op ijs staan.
   OPMERKING: De DMF-compatibele transfectiebuffer die hier wordt gebruikt, is een isotonische buffer met lage geleidbaarheid (geleidbaarheid: 3,5 mS/cm, osmolaliteit: 305 mOsm/L). Onderzoekers die alternatieve buffers gebruiken, moeten compatibiliteit met DMF-actuatie en cellevensvatbaarheid verifiëren. Het biocompatibele niet-ionische oppervlakteactieve stof dient om het vastzetten van druppels te verminderen; als het aangeleverde oppervlakteactieve middel niet wordt gebruikt, een geschikt alternatief.
2. Was geactiveerde T-cellen één keer met Transfection Buffer (zonder tensideer). Centrifugeer op 180 × g gedurende 5 minuten, aspireer het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in een Complete Transfection Buffer (met tensideer) bij 1,0 × 10⁷ cellen/mL in een totaal volume van 100 μL per cartridge. Blijf op ijs.
3. Onmiddellijk voordat je het op de cartridge laadt, voeg je Cas9-nuclease direct toe aan de 100 μL T-cel suspension en meng door zacht pipetteren; blijf op ijs.
   OPMERKING: Voor primaire T-cellen wordt Cas9 geladen met 42 pmol per 100 μL patroonvolume (0,42 pmol/μL). Elke elektroporatieplaats verwerkt ongeveer 1 μL celsuspensie, waarbij 0,42 pmol Cas9 per bewerking wordt geleverd. Optimaliseer deze dosering bij het aanpassen aan andere immuunceltypen (zie Tabel 1).

Component	Eindconcentratie per bewerking
Cas9	0,42 pmol in ~1 μL druppel
sgRNA	2,1 pmol (van 40 nL spot)
PGA	44,4 mg/mL voorraad in spottingmengsel
Oppervlakteactieve stof	0,05% (v/v)
Celinvoer	~10.000 cellen

Tabel 1: Samenvattende tabel van de eindconcentraties in elke transfectiedruppel.

4. Transfectie op het DMF-ectionplatform

1. Met een multikanaals pipet doseert u 10 μL van het T-cel/Cas9-mengsel in elk van de 8 cellaadpoorten, en 10 μL volledige transfectionbuffer in de 16 vloeibare elektrode-laadpoorten (zoals weergegeven in Figuur 1).
2. Stel de spanning in op 500 V, de pulsduur op 3 ms en het aantal pulsen op 2. Start de elektroporatiesequentie volgens de platforminstructies.
   1. Checkpoint: Bekijk direct na de run het QC-rapport na de run. Sporadische falen (<10% van de locaties) vereisen geen interventie. Als de storingen systematisch zijn, vervang dan de cartridge door de meegeleverde kwaliteitscontrolekaart, voer de Systeemgezondheidscontrole uit (~2 min) en neem contact op met technische ondersteuning als de problemen aanhouden.

5. Ontlading en herstel van bewerkte T-cellen

1. Met behulp van een vloeistofbehandelaar wordt elektroporatieve cellen van elke reactieplaats overgebracht naar een 96-put U-bodemplaat met 150 μL voorverwarmd basaal T-celmedium, aangevuld met 200 IU/mL IL-2.
2. Incubeer cellen 72 uur bij 37 °C, 5% CO₂ om eiwitomzet en veranderingen in de expressie van oppervlaktereceptoren mogelijk te maken.

6. Flowcytometrie-analyse van TRAC knockout

1. Cellen overbrengen naar een steriele 96-put conische bodemplaat om celverlies tussen washes te verminderen. Was cellen twee keer met Flow Cytometry Buffer (1× PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA) door te centrifugeren op 400 × g gedurende 5 minuten en het supernatant te verwijderen door de conische bodemplaat voorzichtig om te draaien. Cellen blijven pelleted in de plaat.
2. Bereid een oppervlaktekleurings-mastermix voor met anti-CD4, anti-CD8 en anti-TCRα/β antilichamen in een flow cytometry buffer bij door de fabrikant aanbevolen concentraties. Voeg per put 25 μL van de mastermix toe en incubeer 20 minuten bij 4 °C, beschermd tegen licht. Was twee keer met 1× PBS (zonder FBS) door 5 minuten te centrifugeren op 400 × g . Sussief cellen opnieuw in 100 μL van 1× PBS met een levensvatbaarheidskleurstof op 1:1.000 (v/v) en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur die beschermd is tegen licht.
   OPMERKING: Conische bodemplaten zijn effectief bij pelleting cellen; Controleer of cellen in alle stappen goed zijn geresuspendeerd.
3. Was cellen twee keer met een Flow Cytometry Buffer en susseer opnieuw in 150–200 μL per monster voor opname.
4. Configureer de cytometer met geschikte laserlijnen en filtersets voor de gebruikte fluorochromen (bijv. 488 nm excitatie voor levensvatbaarheidskleurstof; 405 nm of 488 nm voor oppervlaktemarkers indien van toepassing). Stel de spanningen in met single-stain-compensatieregelaars en een ongekleurd monster. Verzamel minimaal 5.000 live singlet-evenementen per monster. Gate sequentieel op: scatter singlets → levende cellen (levensvatbaarheidskleurstof negatief) → CD4⁺ of CD8⁺ → TCRα/β expressie.
   OPMERKING: Onder standaardomstandigheden kunnen het totaal aantal live gebeurtenissen variëren van 5.000 tot meer dan 10.000 per monster na verlies tijdens het wassen en kleuren, mits de cellen de tijd hebben gehad om te vermenigvuldigen.
5. Bepaal TRAC-genverstoring door de frequentie van TCRα/β-negatieve cellen binnen de CD4⁺- en CD8⁺-populaties te meten. Rapporteer knockout-efficiëntie als het percentage TCRα/β-negatieve cellen ten opzichte van de live singlet-poort voor elke subset.

Resultaten

Verwachte uitkomsten
Elektroporatie van 10.000 geactiveerde T-cellen per aandoening resulteert doorgaans in >85% TRAC knockout-efficiëntie met >95% levensvatbaarheid 72 uur na transfectie. Flowcytometrie toont een duidelijk verlies van TCRα/β-kleuring in de TRAC-targetingconditie ten opzichte van niet-doelgerichte sgRNA-controles (NTC) en controles die niet aan elektrische velden zijn blootgesteld. Tenzij anders vermeld, staat n voor onafhankelijke DMF-ection...

Discussie

Dit protocol beschrijft een geminiaturiseerde digitale microfluidische elektroporatieworkflow die efficiënte intracellulaire levering in primaire menselijke T-cellen mogelijk maakt met nanoliter-druppels. Een centraal voordeel van deze methode is de mogelijkheid om CRISPR–Cas9 genoombewerking uit te voeren met slechts 10.000 cellen per reactie, wat de materiaalbehoefte aanzienlijk vermindert ten opzichte van conventionele elektroporatie. De druppelgebaseerde architectuur ondersteunt auto...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Instrumentatie
1x PBS	Gibco		Flow Buffer
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Spheroid protocol
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Spheroid protocol
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Instrumentatie
DMEM Media	Gibco	10564011	Media Supplement- Spheroid culture
DMF compatible buffer	DropGenie		Transfectie
DropGenie Transfection System	DropGenie		Instrumentatie
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Flow Buffer
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		Instrumentatie
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Media Supplement- Spheroid culture
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Instrumentatie
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		Spheroid protocol
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	T cell media supplement
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		Peripheral Blood, Cryopreserved, pan CD3+ Helper T Cells, Negatively Selected
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	T Cell Activation media
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	T Cell Activation media
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Instrumentatie
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	Instrumentatie
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Media Supplement- Spheroid culture
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	Gebruik a bij 100mg/ml
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Software
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Spheroid protocol
Surfactant F	DropGenie		Transfectie- gebruik bij 1:20 in DMF compatibele buffer om complete Transfectie buffer te maken
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	Spheroid protocol