Onderzoeksartikel

NEAT1-gemedieerde dysfunctie van de darmbarrière via miR-29b-3p-binding in door lipopolysacharide beschadigde Caco-2-cellen

DOI:

10.3791/71021

⸱

14 augustus 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Heyuan Street Community Healthcare Center of Heilongjiang Province Daqing City Datong District, 2Department of Gastroenterology, The Second Hospital of Hebei Medical University, 3Department of Gastroenterology, Shanghai Pudong New Area People's Hospital, 4Department of organ Transplantation, Shanxi Bethune Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Third Hospital of Shanxi Medical University, Tongji Shanxi Hospital

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie evalueerde NEAT1 als diagnostische marker en regulator van intestinale barrièredisfunctie bij diarree-predominant prikkelbare darm syndroom. NEAT1 was verhoogd in het serum van patiënten, bond miR-29b-3p, en de knockdown ervan verbeterde de barrière-, apoptose- en inflammatoire resultaten in lipopolysaccharide-beschadigde Caco-2-cellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De pathogenese van prikkelbare darm syndroom met diarree (PDS-D) is onduidelijk en de beschikbare therapieën blijven beperkt. Deze studie evalueerde de diagnostische waarde van NEAT1 bij PDS-D en onderzocht het potentiële regulatiemechanisme ervan. In totaal werden 116 patiënten met PDS-D en 116 gezonde controles opgenomen. Serumspiegels van NEAT1 en miR-29b-3p werden gedetecteerd via reverse transcriptie kwantitatieve real-time PCR (RT-qPCR), en receiver operating characteristic (ROC)-curves werden gebruikt om de diagnostische waarde te evalueren. Voor mechanistische studies werd een model van Caco-2 darmepitheelcellen behandeld met lipopolysacharide (LPS) opgezet. De cellevensvatbaarheid werd beoordeeld met een Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay, apoptose via flowcytometrie, barrièreintegriteit via transepitheliale elektrische weerstand (TEER), en de mRNA-spiegels van ZO-1, occludine en claudine-2 via RT-qPCR. Dual-luciferase reporter (DLR) en RNA-immunoprecipitatie (RIP) assays werden gebruikt om de bindingsrelatie tussen NEAT1 and miR-29b-3p te verifiëren. NEAT1 was sterk tot expressie gebracht en miR-29b-3p vertoonde een lage expressie bij patiënten met PDS-D, waarbij hun spiegels een sterke negatieve correlatie vertoonden. Knockdown van NEAT1 verhoogde de miR-29b-3p spiegels, verbeterde de cellevensvatbaarheid en TEER, verminderde apoptose, verhoogde de mRNA-spiegels van ZO-1 en occludine, verlaagde de mRNA-spiegels van claudine-2 en verlichtte de read-outs geassocieerd met barrièrebeschadiging in LPS-behandelde Caco-2 cellen. Samen wijzen deze resultaten erop dat serum NEAT1 een kandidaat-biomarker is voor PDS-D en dat de NEAT1/miR-29b-3p as betrokken kan zijn bij intestinale barrièredysfunctie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prikkelbare darmensyndroom met diarree (PDS-D) is een veelvoorkomende functionele gastro-intestinale aandoening die wordt gekenmerkt door buikpijn, een opgeblazen gevoel en een veranderd ontlastingspatroon1. Op dit moment is het pathofysiologische mechanisme van PDS-D nog niet volledig opgehelderd2. De behandelmethoden zijn voornamelijk gericht op symptomatische verlichting, met een beperkte effectiviteit en een hoog recidiefpercentage3. Men gaat er over het algemeen van uit dat PDS-D het resultaat is van de interactie tussen meerdere factoren, zoals ontregeling van de hersen-darm-as, viscerale hypersensitiviteit, laaggradige intestinale inflammatie en barrièredefecten4,5. Hoewel deze criteria de diagnose tot op zekere hoogte hebben gestandaardiseerd, zijn ze subjectief en kunnen ze leiden tot diagnostische vertragingen of misclassificaties, vooral wanneer de symptomen van de patiënt overlappen met die van inflammatoire darmziekten of andere organische aandoeningen. In de routinematige klinische praktijk zijn er momenteel geen gevalideerde objectieve biomarkers voor PDS-D. Daarom is het verkennen van een nieuw moleculair doelwit dat als diagnostisch instrument kan dienen en een potentiële therapeutische waarde heeft, een dringende behoefte geworden in het huidige onderzoeksveld naar PDS-D.

In recente jaren hebben lange niet-coderende RNA's, als sleutelmoleculen in epigenetische regulatie, een groot potentieel getoond als diagnostische markers en therapeutische doelwitten bij een verscheidenheid aan ziekten6,7. De belangrijkste oorzaak van IBS-D is een verslechtering van de darmbarrièrefunctie8. De vernietiging van tight junction-eiwitten leidt tot "intestinal leakage", wat op zijn beurt de mucosale immuunrespons activeert9,10. De activatie van het immuunsysteem laat talrijke pro-inflammatoire factoren vrij die darmdisfunctie kunnen veroorzaken door het immuun-zenuwstelsel van de darm te activeren. Studies hebben aangetoond dat sommige lncRNA's de darmepitheelbarrière kunnen reguleren11,12. Er is gerapporteerd dat NEAT1 is upgereguleerd in het colonmucosale weefsel van patiënten met colitis13. Remming van LncRNA NEAT1 kan dysfunctie in darmepitheelcellen (IEC's) bij colitis ulcerosa verlichten14. Echter, het expressieprofiel van NEAT1 bij IBS-D en de diagnostische waarde ervan zijn nog niet onderzocht. Bovendien kan NEAT1 potentieel hebben als diagnostische biomarker15. Als NEAT1 abnormaal tot expressie komt in het serum van patiënten met IBS-D, zou dit de huidige Rome IV-criteria kunnen aanvullen door een moleculaire diagnostische tool te bieden. Ondertussen is het miRNA-expressieprofiel ook significant veranderd bij patiënten met IBS. Zo is de downregulatie van de expressie van miR-29b-3p geassocieerd met de pathogenese van IBS16. De stroomopwaartse regulatiemechanismen die de expressie van miR-29b-3p bij IBS-D bepalen, blijven echter geheel onverkend. In het bijzonder is de rol van NEAT1 als competitief endogeen RNA (ceRNA) voor miR-29b-3p in de context van IBS-D nooit onderzocht, hoewel dit mechanisme goed is vastgesteld bij andere ziekten17,18. Bovendien, terwijl eerdere studies zich primair hebben gericht op expressie op weefselniveau, blijft het potentieel van circulerend NEAT1 als niet-invasieve serumbiomarker voor het diagnosticeren van IBS-D volledig onbekend.

Wij stellen hypothetisch dat lncRNA-NEAT1 kan deelnemen aan de regulatie van de darmbarrièrefunctie bij IBS-D door te fungeren als een ceRNA die miR-29b-3p wegvangt. Op basis van de bovenstaande onderzoekachtergrond heeft deze studie als doel om: (1) de spiegels van NEAT1 en miR-29b-3p in het serum van IBS-D-patiënten en hun diagnostische waarde te evalueren; (2) de directe bindingsinteractie tussen NEAT1 en miR-29b-3p te valideren; en (3) de functionele rol van de NEAT1/miR-29b-3p-as in de regulatie van de darmbarrièreintegriteit en ontsteking te verduidelijken met behulp van een LPS-behandeld Caco-2-celmodel.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Insluiting van patiënten

Alle deelnemers gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming nadat zij de inhoud van het onderzoek volledig hadden begrepen. De ethische commissie van het Shanghai Pudong New Area People's Hospital heeft dit onderzoeksprotocol beoordeeld en goedgekeurd (Nr. 2024k007). De steekproefomvang werd berekend met G*Power: de geselecteerde test was een t-test, en de statistische test was ontworpen om verschillen tussen twee onafhankelijke steekproeven te detecteren. Met een effectgrootte van d = 0,5, α = 0,05 en power = 0,9 gaf de berekening aan dat er minimaal 86 proefpersonen per groep geïncludeerd moesten worden. Om rekening te houden met mogelijke onvoorziene omstandigheden tijdens de studie, werden 116 patiënten per groep geïncludeerd. In totaal werden 116 patiënten met IBS-D die tussen juli 2024 en juli 2025 het Shanghai Pudong New Area People's Hospital bezochten, opgenomen in deze studie als de experimentele groep. De inclusiecriteria waren: (1) IBS-D conform de diagnostische criteria van Rome IV; (2) colonoscopie die geen organische letsels in de mucosa aantoonde. Exclusiecriteria: (1) patiënten met inflammatoire darmziekten (IBD), colorectale kanker, etc.; (2) diabetespatiënten; (3) patiënten met een recente voorgeschiedenis van abdominale chirurgie; en (4) patiënten met ernstig hart-, lever- of nierinsufficiëntie. Ondertussen werden 116 gezonde vrijwilligers die overeenkwamen met de demografische kenmerken van de patiënten, zoals leeftijd en geslacht, geworven als controlegroep. Voor de gezonde controles werd bevestigd dat er geen sprake was van een voorgeschiedenis van chronische gastro-intestinale aandoeningen of overeenkomstige klinische symptomen. Van alle proefpersonen werd vijf milliliter perifeer veneus bloed afgenomen. Het supernatant werd vervolgens overgebracht naar een ultra-laagtemperatuurvriezer bij -80 °C voor cryopreservatie voorafgaand aan de daaropvolgende RNA-extractie.

Elke deelnemer vulde een vragenlijst over een periode van 10 dagen in om de volgende klinische manifestaties vast te leggen: (a) beoordeling van de ernst van de buikpijn met behulp van een visuele analoge schaal van 10 punten; (b) frequentie van buikpijn tijdens de onderzoeksperiode (aantal pijnlijke dagen); (c) frequentie van de stoelgang (maximaal aantal stoelgangen per dag); (d) de Bristol Faecal Form Scale om de ontlastingskenmerken te beoordelen. De emotionele toestand van de proefpersonen werd geëvalueerd met de Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS).

Celkweek en modellering

Caco-2-cellen werden routinematig gekweekt in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mengandung 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine, in een incubator bij 37 °C en 5% CO₂. De Caco-2-cellijn differentieert spontaan tot een gepolariseerde monolaag van cellen met tight junctions en microvilli, waarbij morfologische en functionele kenmerken worden vertoond die vergelijkbaar zijn met die van mature intestinale epitheelcellen. LPS triggert een ontstekingsreactie en verstoort de tight junctions in het intestinale epitheel, waardoor de intestinale permeabiliteit toeneemt—een proces dat sterk lijkt op de pathologische kenmerken van IBS-D. Bovendien, aangezien LPS-behandelde Caco-2-cellen in eerdere studies19,20,21 breed zijn gebruikt om IBS-gerelateerde barrièredysfunctie en ontsteking te modelleren, werd in deze studie gekozen voor behandeling van Caco-2-cellen met lipopolysaccharide (LPS) om een in vitro model van IBS-D te vestigen. Zodra de cellen een confluentie van ongeveer 80% hadden bereikt, werd het kweekmedium vervangen door compleet medium mengandung 5 µg/ml LPS22, en werden de cellen gedurende 24 h gestimuleerd. Conventioneel gekweekte cellen zonder LPS werden als controlegroep gebruikt.

Celtransfectie

Om de rollen van NEAT1 en miR-29b-3p in Caco-2-cellen te onderzoeken, werden Caco-2-cellen getransfecteerd. De cellen werden als volgt verdeeld in zes groepen: 1. controlegroep (geen behandeling); 2. LPS-groep; 3. LPS + si-NC-groep; 4. LPS + si-NEAT1-groep; 5. LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC-groep; en 6. LPS + si-NEAT1 + miR-29b-3p inhibitor-groep. Er werden twee small interfering RNA's (si-NEAT1) ontworpen en gesynthetiseerd die gericht waren op NEAT1: si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) en si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). Een siRNA met een willekeurige niet-targeterende sequentie (si-NC) werd gebruikt als negatieve controle. Tegelijkertijd werden de miR-29b-3p inhibitor en de bijbehorende negatieve controle gesynthetiseerd. miR-29b-3p inhibitor: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. Negatieve controle: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.

Caco-2-cellen werden uitgeplaat in 24-wellplaten en getransfecteerd zodra de culturen een confluentie van 60–70% hadden bereikt, volgens het protocol van de fabrikant. Kort samengevat werd 1,25 µL siRNA verdund in 25 µL serumarm medium om een uiteindelijke siRNA-concentratie van 50 nM te verkrijgen. Voor miRNA-inhibitie werd 2 µL van de miR-29b-3p-inhibitor of de negatieve controle verdund in 25 µL serumarm medium tot een uiteindelijke concentratie van 100 nM. Apart werd 1,5 µL van het transfectiereagens gemengd met 25 µL serumarm medium. Het verdunde siRNA (of de inhibitor/negatieve controle) werd vervolgens gemengd met het verdunde transfectiereagens om het transfectiecomplex te vormen, dat druppelsgewijs aan de cellen werd toegevoegd. Zes uur na transfectie werd het transfectiemengsel vervangen door vers compleet medium en werden de cellen nog 48 u onderhouden voordat de functionele downstream-assays werden uitgevoerd. De knockdown- of inhibitie-efficiëntie werd vóór verdere experimenten bevestigd via RT-qPCR.

Real-time kwantitatieve reverse transcriptie-PCR (RT-qPCR)

Totaal RNA werd geïsoleerd uit serummonsters en Caco-2-cellen die waren onderworpen aan de aangegeven behandelingen. Kort samengevat werd elk monster gelyseerd met 1 mL RNA-extractiereagens en gecombineerd met 200 µL chloroform. Na centrifugatie bij 12.000 × g gedurende 15 min bij 4 °C werd de bovenste waterige fase overgebracht naar een nieuwe buis, gemengd met 500 µL isopropanol en 30 min bij −20 °C bewaard. De monsters werden vervolgens gecentrifugeerd bij 12.000 × g gedurende 10 min bij 4 °C. Het resulterende RNA-pellet werd tweemaal gewassen met 75% ethanol, aan de lucht gedroogd en opnieuw opgelost in 20 µL RNase-vrij water. De RNA-opbrengst en -zuiverheid werden gemeten met een microspectrofotometer, en alleen monsters met A260/A280 waarden van 1,8–2,0 werden gebruikt. Het RNA werd omgezet in cDNA via reverse transcriptie volgens het protocol van de fabrikant. Voor de detectie van NEAT1, ZO-1, occludine, claudine-2, en GAPDHVoor elke reverse-transcriptiereactie van 20 µL werd 1 µg totaal RNA gebruikt, bestaande uit 1× RT-buffer, 0,5 mM dNTP's, 0,5 µM oligo(dT)-primer, 200 U reverse transcriptase en RNase-vrij water. De reactie werd uitgevoerd bij 37 °C gedurende 15 min, gevolgd door inactivatie van het enzym bij 85 °C gedurende 5 s.

Kwantitatieve PCR werd uitgevoerd met cDNA als template met behulp van een SYBR Green-gebaseerd real-time PCR-systeem. De expressieniveaus van NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, occludin, en claudin-2 werden gemeten met genspecifieke primers. U6 diende als referentiegen voor miR-29b-3p, terwijl GAPDH werd gebruikt om NEAT1 en tight junction-gerelateerde genen te normaliseren. De relatieve expressie werd berekend met de 2−ΔΔCt-methode. De primersequenties zijn opgenomen in Tabel 1.

Cellevensvatbaarheidsassay

Caco-2-cellen in de log-fase werden gezaaid in 96-wells platen met 1 × 104 cellen per well. Er werden een blanco controlegroep (bevatten enkel het kweekmedium), een controlegroep (onbehandelde cellen) en een experimentele groep (Caco-2-cellen onder verschillende behandelingscondities) ingericht, met 5–6 dubbele wells per groep. De cellen werden toegewezen aan vier tijdspunten: 0, 24, 48 en 72 h. Voor elk tijdspunt werd een aparte kweekplaat klaargemaakt om te voorkomen dat de incubator tijdens de metingen herhaaldelijk geopend moest worden. Na de kweekperiode werd aan elke well 10 µL CCK-8-oplossing toegevoegd, waarbij vorming van belletjes werd vermeden. Vervolgens werd de kweekplaat teruggeplaatst in een incubator bij 37 °C en 5% CO₂ en gedurende 2 h in het donker geïncubeerd. De absorbentie van elke well werd onmiddellijk gemeten bij 450 nm met een microplatereader. Uiteindelijk werd de celviabiliteit uitgedrukt als een percentage.

Celapoptose-assay

Apoptose werd gekwantificeerd met flowcytometrie na Annexine V-FITC/PI-kleuring. Caco-2-cellen van elke behandelingsgroep werden geoogst en tweemaal gespoeld met ijskoud PBS. Centrifugatie werd uitgevoerd bij 300 × g gedurende 5 min bij 4 °C. De celpellet werd vervolgens geresuspendeerd in 100 µL 1× bindingsbuffer, gevolgd door de opeenvolgende toevoeging van 5 µL Annexine V-FITC en 5 µL PI. Na voorzichtig mengen werden de monsters 15 min bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd. Vervolgens werd 300 µL 1× bindingsbuffer toegevoegd en werd de suspensie zorgvuldig gemengd vóór overdracht naar een flowcytometrie-buis van 5 mL. De monsters werden binnen 1 u geanalyseerd met flowcytometrie.

Transepitheliale elektrische weerstand (TEER)

De permeabiliteit werd beoordeeld door de TEER-waarden van Caco-2-cellen te meten23. Caco-2-cellen werden geïnoculeerd in Transwell-kamers en gedurende 21 dagen gekweekt om een dichte monolaag te vormen. Voor elke experimentele conditie werden zes onafhankelijke biologische replica's uitgevoerd, en daarnaast werden onder elke conditie vijf technische replica's uitgevoerd. Voor en na de experimentele behandeling werden de TEER-waarden van elke groep gemeten met een transmembraanweerstandsmeters met elektroden die waren gesteriliseerd met ethanol en gebalanceerd met PBS. Kort samengevat werd de lange staaf van de elektrode ondergedompeld in het basolaterale kweekmedium en de korte staaf in het apicale kweekmedium, om contact met het filtermembraan te vermijden. Na stabilisatie werd de weerstandswaarde (Ω) afgelezen, en de metingen werden herhaald totdat drie consistente readings waren verkregen. De weerstand van blanco Transwell-filters (zonder cellen) werd onder dezelfde omstandigheden gemeten, en deze waarde werd van alle experimentele readings afgetrokken. TEER (Ω·cm2) = (weerstand monster – blanco weerstand) × effectief membraanoppervlak. Gegevens worden gepresenteerd als: (experimentele groep/controlegroep) × 100%.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

De supernatanten van Caco-2-cellen uit verschillende behandelingsgroepen werden verzameld na 24 u cultuur. De spiegels van pro-inflammatoire cytokinen, waaronder tumornecrosefactor-alfa (TNF-α), interleukine-6 (IL-6), interleukine-8 (IL-8) en interleukine-1β (IL-1β), werden gemeten met commerciële ELISA-reagentia volgens de instructies van de fabrikant. De assay werd strikt uitgevoerd in overeenstemming met de instructies. De monsters en standaarden werden toegevoegd aan de wells die vooraf waren gecoat met antilichamen, waarna ze werden geïncubeerd en gewassen. Vervolgens werd het gebiotinyleerde detectieantilichaam toegevoegd. Na een verdere incubatie en wasstap werd streptavidine gelabeld met mierikswortelperoxidase toegevoegd. Ten slotte werd het TMB-substraat toegevoegd voor kleurontwikkeling, waarna de reactie werd beëindigd met de stopoplossing. De absorbantie van elke well werd onmiddellijk gemeten bij 450 nm met een microplate reader.

Western blot

Eiwitten werden geïsoleerd uit Caco-2-cellen na de aangegeven behandelingen met behulp van RIPA-buffer met proteaseremmers. Eiwitgehaltes werden gemeten met een bicinchoninezuur (BCA)-assay. Voor elk monster werd 30 µg eiwit per lane geladen, gescheiden op 10% SDS-PAGE-gels en overgebracht op PVDF-membranen. De membranen werden 1 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd in 5% vetarme melk en vervolgens overnight bij 4 °C geïncubeerd met antilichamen tegen ZO-1 (1:1.000), occludine (1:500), claudine-2 (1:1.000) en GAPDH (1:5.000). Na het wassen werden de membranen 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen. Banden werden gedetecteerd via verbeterde chemiluminescentie (ECL) en de bandintensiteit werd geanalyseerd met ImageJ. GAPDH diende als loading control.

Dual-luciferase reporter (DLR) assay

De potentiële bindingsplaatsen van miR-29b-3p aan de NEAT1-sequentie werden voorspeld via de ENCORI-database (https://rnasysu.com/encori/). Vervolgens werden NEAT1-fragmenten met wildtype (WT) of gemuteerde (MUT) bindingsplaatsen gekloond in de pmirGLO-reportervector. Het geconstrueerde recombinante plasmide werd samen met miR-29b-3p mimics (Sense: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antisense: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) of inhibitoren en hun respectievelijke negatieve controles (mimic NC, Sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antisense: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’) in de cellen getransfecteerd. Vierenveertig uur na transfectie werden de cellen geoogst en werden de activiteiten van firefly luciferase en renilla luciferase bepaald met behulp van een dual luciferase detectiereagens. De renilla luciferase-activiteit diende als interne referentie voor standaardisatie.

RNA-immunoprecipitatie (RIP)-assay

Voor de RIP-assay werden Caco-2-cellen geoogst, gespoeld met PBS en 15 min op ijs geïncubeerd in 200 µL RIP-lysebuffer aangevuld met protease- en RNase-remmers. Cellysaten werden gecentrifugeerd bij 16.000 × g gedurende 10 min bij 4 °C, waarbij 10 µL van elk supernatant werd bewaard als inputcontrole. Voor immunoprecipitatie werden 40 µL Protein A/G-magnetische beads gedurende 30 min bij kamertemperatuur geroteerd met 5 µg anti-Ago2-antilichaam of normaal IgG in 200 µL RIP-wasbuffer. Na drie wasbeurten met 500 µL RIP-wasbuffer werd 100 µL van de bead-suspensie gecombineerd met 100 µL lysaat, aangevuld tot een eindvolume van 1 mL met RIP-wasbuffer, en overnight bij 4 °C geïncubeerd onder rotatie. De beads werden vervolgens vijf keer gewassen met 500 µL RIP-wasbuffer en resuspendeerd in 150 µL van dezelfde buffer. Proteïnevertering werd uitgevoerd door toevoeging van 15 µL proteinase K (20 mg/mL) en 15 µL 10% SDS, gevolgd door incubatie bij 55 °C gedurende 30 min met schudden. Het supernatant werd verzameld en RNA werd geïsoleerd met het extractiereagens en overnight geprecipiteerd. De verrijking van NEAT1 en miR-29b-3p werd vervolgens bepaald via RT-qPCR.

Subcellulaire lokalisatieanalyse

Caco-2 cellen werden gescheiden in nucleaire en cytoplasmatische fracties met behulp van het genoemde commercieel verkrijgbare reagens voor nucleair-cytoplasmatische scheiding, volgens de instructies van de fabrikant. Totaal RNA werd geëxtraheerd uit deze twee componenten, en de distributie van NEAT1 in de nucleus en het cytoplasma werd gedetecteerd via RT-qPCR. De kalibratie werd uitgevoerd met U6 (voornamelijk nucleair) en GAPDH mRNA (voornamelijk cytoplasmatisch) als indicatoren voor de scheidingsactiviteit.

Statistische analyse

Voor klinische serummonsters gaf een poweranalyse (t-toets, d = 0.5, α = 0.05, power = 0.9) aan dat een minimum van 86 proefpersonen per groep vereist was. Om rekening te houden met eventuele onvoorziene omstandigheden tijdens het onderzoek, werden 116 patiënten per groep geïncludeerd om klinisch significante verschillen te kunnen detecteren. De normaliteit van de data voor continue variabelen werd geëvalueerd met de Shapiro-Wilk-toets. Omdat alle continue data normaal verdeeld waren (P > 0.05), werden parametrische analyses toegepast. Categorische variabelen werden geanalyseerd met de chi-kwadraattoets. Cel-gebaseerde experimenten omvatten zes onafhankelijke biologische replica's, met vijf technische replica's voor elke biologische replica. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Vergelijkingen tussen twee groepen met continue variabelen werden uitgevoerd met de Student's t-toets, terwijl vergelijkingen tussen meerdere groepen werden geanalyseerd via een eenweg-ANOVA gevolgd door de post-hoc toets van Tukey. Statistische significantie werd gedefinieerd als P < 0.05.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Expressie van NEAT1 en diagnostische waarde

Vergeleken met de gezonde controlegroep (HC) waren de expressieniveaus van NEAT1 bij IBS-D-patiënten merkbaar hoger (P < 0,0001; Figuur 1A). De oppervlakte onder de curve (AUC) van NEAT1, zoals weergegeven door de receiver operating characteristic (ROC)-curve, was 0,867 (95% BI: 0,821–0,913). De specificiteit was 75,9%, terwijl de sensitiviteit 84,5% bedroeg (Figuur 1B). Dit suggereert dat een abnormale NEAT1-expressie in het serum van patiënten met IBS-D kan dienen als een nieuwe diagnostische biomarker voor deze aandoening.

Daarnaast werden de klinische gegevens van patiënten in de gezonde groep en de IBS-D-groep vergeleken. De resultaten lieten geen significante verschillen zien tussen de twee groepen wat betreft leeftijd, geslacht of andere kenmerken (P > 0,05). Er waren echter wel significante verschillen in HADS, stoelgang en fecesconsistentie (P < 0,0001, Tabel 2). Wat betreft de frequentie van buikpijn ervoeren 69 patiënten symptomen gedurende ≥ 5 dagen, wat overeenkomt met 59,48% van de gevallen. Wat betreft de ernst van de buikpijn had 72 patiënten een score ≥ 5, wat overeenkomt met 62,07% (Tabel 2). Dit betekent dat patiënten met IBS-D duidelijk te onderscheiden zijn van de controlegroep op basis van hun symptomen. Gezien de klinische associatie tussen verhoogde NEAT1 en IBS-D-symptomen, hebben we vervolgens de functionele impact van NEAT1 op de integriteit van de darmbarrière onderzocht met behulp van een LPS-behandeld Caco-2-celmodel.

Effecten van lage niveaus van NEAT1 op beschadiging van de darmbarrière en ontstekingsreacties in LPS-behandelde Caco-2-cellen

Om de dysfunctie van de darmbarrière en de lichte ontsteking te modelleren die worden gezien bij IBS-D, hebben we Caco-2-cellen behandeld met LPS. Wanneer LPS aan de cellen werd toegevoegd, waren de NEAT1-niveaus verhoogd in vergelijking met de controlegroep. Na transfectie met si-NEAT1 was het NEAT1-niveau aanzienlijk verlaagd vergeleken met de LPS + si-NC-groep (P < 0,0001, Figuur 2A). LPS-behandeling verminderde de cellevensvatbaarheid en verhoogde de apoptose ten opzichte van de controlegroep. Na het uitschakelen van NEAT1 nam de cellevensvatbaarheid toe en daalde de apoptosesnelheid in vergelijking met de LPS + si-NC-groep (P < 0,001; Figuur 2B,C). Na het uitschakelen van NEAT1 werd de door LPS verlaagde TEER significant hersteld (P < 0,0001, Figuur 2D). LPS verlaagde de mRNA-expressie van ZO-1 en occludine en verhoogde de expressie van claudine-2 ten opzichte van de controles, terwijl knockdown van NEAT1 deze veranderingen tenietdeed (P < 0,001, Figuur 2E-G). Behandeling met LPS kan een ontstekingsreactie in cellen uitlokken. De niveaus van de pro-inflammatoire factoren TNF-α, IL-6, IL-8 en IL-1β in de cellen waren hoger dan in de controlegroep. Na knockdown van NEAT1 waren de hoeveelheden pro-inflammatoire factoren in de cellen significant afgenomen in vergelijking met de si-NC-groep (P < 0,0001, Figuur 3A-D). Dit suggereert dat lage NEAT1-niveaus de door LPS geïnduceerde dysfunctie van de darmbarrière en ontstekingsreacties verminderen, en dat NEAT1 kan bijdragen aan de progressie van IBS-D.

Directe binding van NEAT1 en effecten op miR-29b-3p in Caco-2-cellen

In Caco-2-cellen bevindt NEAT1 zich primair in het cytoplasma (Figuur 4A). De bindingsplaatsen van NEAT1 en miR-29b-3p werden voorspeld met de ENCORI-database. Op basis hiervan hebben we de WT-NEAT1 en MUT-NEAT1 sequenties ontworpen (Figuur 4B). De DLR-experimentele resultaten gaven aan dat miR-29b-3p mimics de enzymatische activiteit van WT-NEAT1 reduceerden ten opzichte van de mimic NC, terwijl de inhibitoren deze verhoogden ten opzichte van de inhibitor NC. Omgekeerd had geen van beide behandelingen enige invloed op MUT-NEAT1 (P < 0,0001, Figuur 4C). De RIP-assay onthulde dat NEAT1 en miR-29b-3p merkbaar overvloedig aanwezig waren in de anti-Ago2-fractie vergeleken met de anti-IgG-groep, wat wijst op een specifieke interactie tussen de twee (P < 0,0001, Figuur 4D). Deze resultaten geven aan dat NEAT1 specifiek bindt aan miR-29b-3p. Ondertussen was het miR-29b-3p-niveau aanzienlijk verlaagd bij IBS-D-patiënten vergeleken met de HC-groep (P < 0,0001, Figuur 4E). De AUC van de bijbehorende ROC-curve was 0,856 (95% BI: 0,808–0,905), met een sensitiviteit van 89,7% en een specificiteit van 71,6% (Figuur 4F). De correlatieanalyse van Pearson onthulde een inverse correlatie tussen de NEAT1-niveaus en de miR-29b-3p-expressie (r = -0,744, P < 0,0001, Figuur 4G).

Effecten van lage NEAT1 op intestinale barrièbeschadiging in LPS-behandelde Caco-2-cellen en miR-29b-3p-niveaus

In met LPS behandelde Caco-2-cellen was de expressie van miR-29b-3p aanzienlijk verlaagd in vergelijking met de controlegroep. Transfectie met si-NEAT1 verhoogde de spiegels van miR-29b-3p, terwijl transfectie met de miR-29b-3p-inhibitor de spiegels van miR-29b-3p opnieuw verlaagde (P < 0,0001, Figuur 5A). Knockdown van NEAT1 verhoogde de celviabiliteit en verminderde apoptose, en deze effecten werden tenietgedaan door de miR-29b-3p-inhibitor (P < 0,01, Figuur 5B,C). De door LPS geïnduceerde afname van de TEER werd hersteld door NEAT1-knockdown, en dit herstel werd opnieuw voorkomen door de miR-29b-3p-inhibitor (P < 0,0001, Figuur 5D). LPS-behandeling leidde tot een verminderde expressie van ZO-1- en occludine-mRNA en een verhoogde expressie van claudine-2-mRNA in vergelijking met de controlegroep. Na NEAT1-knockdown namen de spiegels van miR-29b-3p toe, stegen de mRNA-spiegels van ZO-1 en occludine, en namen de mRNA-spiegels van claudine-2 af in vergelijking met de LPS + si-NC-groep. Na miR-29b-3p-inhibitie namen de mRNA-spiegels van ZO-1 en occludine af, en namen de mRNA-spiegels van claudine-2 toe in vergelijking met de LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC-groep (P < 0,001, Figuur 5E-G). NEAT1 (voornamelijk het cytoplasmatische subtype NEAT1_1) fungeert als een sponge voor miR-29b-3p. Knockdown van NEAT1 laat miR-29b-3p vrij, waardoor ZO-1 en occludine indirect worden opgereguleerd en claudine-2 wordt neergereguleerd, wat de door LPS geïnduceerde barrièrestoornis verlicht. Deze resultaten suggereren dat, in dit model, miR-29b-3p de expressie van ZO-1 en occludine positief reguleert en claudine-2 negatief reguleert, en dat de effecten van NEAT1-knockdown, ten minste gedeeltelijk, worden gemedieerd door miR-29b-3p.

We hebben vervolgens de expressieniveaus van tight junction-eiwitten onderzocht met behulp van western blot-analyse. Zoals getoond in Figuur 5H, verhoogde NEAT1 knockdown de door LPS verlaagde expressie van ZO-1 en occludine en onderdrukte het de expressie van claudine-2 in vergelijking met de LPS + si-NC groep. Co-transfectie met een miR-29b-3p remmer verzwakte echter het beschermende effect van NEAT1 knockdown in vergelijking met de LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC groep. Deze resultaten ondersteunen de conclusie dat NEAT1 knockdown de expressie van tight junction-eiwitten herstelt, ten minste gedeeltelijk door miR-29b-3p op te reguleren, waardoor de intestinale barrièrefunctie wordt verbeterd.

Effecten van lage NEAT1-spiegels op intestinale ontsteking in LPS-behandelde Caco-2-cellen en miR-29b-3p-expressie

In met LPS behandelde Caco-2-cellen triggerde LPS een ontstekingsreactie. De spiegels van de pro-inflammatoire factoren TNF-α, IL-6, IL-8 en IL-1β waren significant hoger dan in de controlegroep. Na NEAT1 knockdown namen de spiegels van miR-29b-3p toe, terwijl de spiegels van pro-inflammatoire factoren significant afnamen vergeleken met si-NC. Na inhibitie van miR-29b-3p namen de spiegels van ontstekingsfactoren opnieuw toe (P < 0,0001, Figuur 6A-D). Daarom onderdrukt NEAT1 knockdown de afgifte van inflammatoire cytokinen, ten minste gedeeltelijk, door opregulatie van miR-29b-3p.

Deze resultaten geven aan dat de NEAT1-spiegels abnormaal verhoogd zijn in het serum van patiënten met IBS-D en dat NEAT1 een hoge AUC heeft voor het onderscheiden van patiënten met IBS-D van gezonde controles. Mechanistisch gezien bindt NEAT1 direct aan miR-29b-3p en sequestreert dit in het cytoplasma. In cellulaire modellen en functionele rescue-experimenten leidde NEAT1-knockdown tot een verhoogde expressie van miR-29b-3p, een verbeterde celoverleving en TEER, een vermindering van apoptose en een afname van de afgifte van pro-inflammatoire cytokinen. Deze bevindingen ondersteunen de hypothese dat NEAT1 de integriteit van de darmbarrière negatief reguleert door miR-29b-3p te remmen, en suggereren dat het targeten van NEAT1 een potentiële diagnostische en therapeutische strategie voor IBS-D kan bieden.

Beschikbaarheid van gegevens:

De ruwe gegevens ten grondslag aan de figuren en tabellen zijn beschikbaar als Supplemental File 1 (ruwe gegevensspreadsheet) en Supplemental File 2 (onbewerkte western blot-afbeeldingen).

lncRNA NEAT1 expressieanalyse en ROC-curve voor HC versus IBS-D; inclusief statistische gegevens.
Figuur 1. Expressie en diagnostische waarde van NEAT1 bij patiënten met IBS-D. (A) NEAT1 expressieniveaus in serum van gezonde controles (HC, n = 116) en IBS-D patiënten (n = 116) gedetecteerd via RT-qPCR; (B) ROC-curve analyse van NEAT1 voor het onderscheiden van IBS-D patiënten van gezonde controles. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 116 per groep). **** P < 0,0001. Afkortingen: IBS-D = prikkelbare darmsyndroom met diarree; ROC = receiver operating characteristic. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Staafdiagramanalyse van genexpressie, cellevensvatbaarheid, apoptosepercentage; vergelijking van experimentele resultaten.
Figuur 2. Effect van NEAT1 op LPS-geïnduceerde beschadiging van de darmbarrière in Caco-2 cellen. (A) Transfectie van si-NEAT1 reduceert de door LPS geïnduceerde NEAT1-niveaus; (B) Cellevensvatbaarheid gemeten met CCK-8 assay op 0, 24, 48 en 72 u. Knockdown van NEAT1 verhoogt de cellevensvatbaarheid; (C) Apoptosepercentage bepaald via flowcytometrie met Annexin V-FITC/PI kleuring. Silencing van NEAT1 verlaagt de apoptosepercentages; (D) Transepitheliale elektrische weerstand (TEER) gemeten in Caco-2 monolagen. Inhibitie van NEAT1 verhoogt de cellulaire TEER; (E-G) mRNA-expressieniveaus van (E) ZO-1, (F) occludine en (G) claudine-2 gemeten via RT-qPCR. Silencing van NEAT1 verhoogt de mRNA-expressie van ZO-1 en occludine, en verlaagt de claudine-2 mRNA-niveaus. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD van zes onafhankelijke experimenten (n = 6 per groep). *** P < 0,001; **** P < 0,0001, LPS vergeleken met controle, LPS + si-NEAT1 vergeleken met LPS + si-NC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Staafdiagram waarin cytokineniveaus worden geanalyseerd: TNF-α, IL-6, IL-8, IL-1β; behandelingen omvatten LPS, si-NC, si-NEAT1.
Figuur 3. Effect van NEAT1 knockdown op LPS-geïnduceerde afgifte van pro-inflammatoire cytokinen in Caco-2-cellen. (A-D) Concentraties van (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8, en (D) IL-1β in celcultuursupernatanten gemeten via ELISA. NEAT1 knockdown reduceert de LPS-geïnduceerde spiegels van TNF-α, IL-6, IL-8 en IL-1β. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD van zes onafhankelijke experimenten (n = 6 per groep). **** P < 0.0001, LPS t.o.v. controle, LPS + si-NEAT1 t.o.v. LPS + si-NC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

RNA-expressieanalyse met staafdiagrammen, sequenties en grafieken; interacties tussen NEAT1 en miR-29b-3p.
Figuur 4. Directe binding van NEAT1 en associatie met miR-29b-3p. (A) Subcellulaire lokalisatie van NEAT1 in Caco-2 cellen bepaald door nucleair-cytoplasmatische fractionering (U6: nucleaire controle, GAPDH: cytoplasmatische controle). NEAT1 bevindt zich hoofdzakelijk in het cytoplasma; (B) Voorspelde WT- en MUT-bindingssequenties van NEAT1 voor miR-29b-3p uit de ENCORI-database; (C) De DLR-assay bevestigde de bindingsrelatie tussen NEAT1 en miR-29b-3p; (D) RIP bevestigde de bindingsrelatie tussen NEAT1 en miR-29b-3p. Gegevens in A, C, en D zijn gemiddelde ± SD uit zes onafhankelijke experimenten (n = 6 per groep). (E) Serum expressieniveaus van miR-29b-3p in gezonde controles (HC, n = 116) en IBS-D patiënten (n = 116); (F) ROC-curve van miR-29b-3p voor het onderscheiden van IBS-D patiënten van gezonde controles; (G) Pearson-correlatieanalyse tussen NEAT1 en miR-29b-3p niveaus in IBS-D patiënten. NEAT1 was negatief gecorreleerd met de expressie van miR-29b-3p (r = -0,744, P < 0,0001). Gegevens in E zijn gemiddelde ± SD (n = 116 per groep). **** P < 0,0001. Afkortingen: WT = wild type; MUT = mutant; DLR = dual-luciferase reporter; RIP = RNA immunoprecipitatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Staafdiagrammen van relatieve expressie, celviabiliteit, apoptoserate, TEER, eiwitexpressie; western blot.
Figuur 5. Effecten van NEAT1-knockdown op de intestinale barrièrefunctie in LPS-behandelde Caco-2-cellen en miR-29b-3p. (A) Knockdown van NEAT1 verhoogt de miR-29b-3p-niveaus, terwijl transfectie met miR-29b-3p-remmers de miR-29b-3p-expressie verlaagt. (B) Celviabiliteit gemeten met een CCK-8-assay. Lage niveaus van NEAT1 verbeteren de celviabiliteit door miR-29b-3p te verhogen; (C) Apoptoserate bepaald via flowcytometrie. Lage niveaus van NEAT1 verlagen de apoptoserate door miR-29b-3p te verhogen; (D) Lage niveaus van NEAT1 verhogen de TEER van cellen door het niveau van miR-29b-3p te verhogen; (E-G) mRNA-expressie van (E) ZO-1, (F) occludine en (G) claudine-2. Lage niveaus van NEAT1 verhogen de expressie van ZO-1 en occludine en verlagen de expressie van claudine-2 mRNA door miR-29b-3p te verhogen. (H) Representatieve western blot-afbeeldingen die de eiwitexpressie van ZO-1, occludine, claudine-2 en GAPDH tonen onder de aangegeven behandelingscondities. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD van zes onafhankelijke experimenten (n = 6 per groep). ** P < 0.01; *** P < 0.001; **** P < 0.0001, LPS vs. controle, LPS + si-NEAT1 vs. LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + miR-remmer vs. LPS + si-NEAT1 + remmer NC. Afkorting: miR-remmer = miR-29b-3p-remmer; TEER = transepitheliale elektrische weerstand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Staafdiagrammen die cytokineniveaus (TNF-α, IL-6, IL-8, IL-1β) tonen in de si-NEAT1 inhibitie-assay.
Figuur 6. Effecten van NEAT1 knockdown op ontsteking in LPS-behandelde Caco-2 cellen en miR-29b-3p. (A-D) Concentraties van (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8, en (D) IL-1β in celcultuursupernatanten gemeten via ELISA. Lage niveaus van NEAT1 verminderen het gehalte aan TNF-α, IL-6, IL-8, en IL-1β in het celsupernatantaat door miR-29b-3p te verhogen. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD uit zes onafhankelijke experimenten (n = 6 per groep). **** P < 0.0001, LPS vs. controle, LPS + si-NEAT1 vs. LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + miR-inhibitor vs. LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC. Afkorting: miR-inhibitor = miR-29b-3p inhibitor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

GenPrimersequentie
NEAT1 forward5’-GTGGCTGTTGGAGTCGGTAT-3’
NEAT1 reverse5’-TAACAAACCACGGTCCATGA-3’
ZO-1 forward5’-GCCGCTAAGAGCACAGCAA-3′
ZO-1 reverse5’-TCCCCACTCTGAAAATGAGGA-3’
Occludin forward5’-ATGGCAAAGTGAATGACAAGCGG-3’
Occludin reverse5’-CTGTAACGAGGCTGCCTGAAGT-3’
Claudin-2 forward5’-GTGACAGCAGTTGGCTTCTCCA-3’
Claudin-2 reverse5’-GGAGATTGCACTGGATGTCACC-3’
miR-29b-3p forward5’-GCTCTAGATCAGTTACAGAAAGACCACGA-3’
miR-29b-3p reverse5’-GCTCTAGATAGTGTCCATGCACGGACC-3’
GAPDH forward5’-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3’
GAPDH reverse5’-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3’
U6 forward5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’
U6 reverse5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’

Tabel 1: Primersequenties.

IndicatorControlegroep (N=116)IBS-D-groep (N=116)P
Leeftijd, jaren
< 4063540,293
≥ 405362
Geslacht
Man64660,895
Vrouw5250
Roken
NEE58530,599
JA5863
Alcoholgebruik
NEE63580,599
JA5358
HADS, score
< 89626< 0,0001
≥ 82090
Ontlasting, aantal keer/dag
< 410351< 0,0001
≥ 41365
Ontlastingsvorm, Bristol-score
< 58725< 0,0001
≥ 52991
Frequentie buikpijn, aantal dagen
< 5/47/
≥ 5/69
Ernst van buikpijn, score
< 5/44/
≥ 5/72

Tabel 2: Vergelijking van demografische en klinische kenmerken tussen gezonde controles en IBS-D-patiënten. Waarden worden weergegeven als deelnemersaantallen per groep (n = 116/groep). Verschillen tussen groepen werden geëvalueerd met de chi-kwadraattoets. Afkorting: HADS = Hospital Anxiety and Depression Scale; IBS-D = prikkelbare darm syndroom met diarree.

Aanvullend bestand 1: Ruwe gegevens ten grondslag aan de figuren en tabellen. Dit bestand bevat de ruwe numerieke gegevens die zijn gebruikt om de kwantitatieve resultaten te genereren die worden getoond in Figuur 1, Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4, Figuur 5 en Figuur 6, en de demografische/klinische gegevens die zijn samengevat in Tabel 2.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Onbewerkte western blot-afbeeldingen.Dit bestand bevat de onbewerkte western blot-afbeeldingen voor ZO-1, occludin, claudin-2 en GAPDH die overeenkomen met het representatieve western blot-paneel getoond in Figuur 5H.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IBS-D is een veelvoorkomende functionele gastro-intestinale stoornis. Het pathologische mechanisme hiervan is nog niet volledig opgehelderd. In recente jaren hebben lncRNA's, als sleutelmoleculen in de epigenetische regulatie, een groot potentieel getoond op het gebied van ziektediagnostiek en -behandeling. LncRNA NEAT1 is bestudeerd bij verschillende aandoeningen, zoals colorectaal carcinoom24, glioom25 en myocardinfarct26. Diverse studies hebben aangetoond dat NEAT1 betrokken is bij de regulatie van ontstekingsreacties13, celproliferatie27 en de integriteit van de darmbarrière28. De specifieke expressie van NEAT1 bij IBS-D, de klinische waarde ervan en de onderliggende regulatiemechanismen bij IBS-D zijn echter nog niet grondig onderzocht.

NEAT1 is upgereguleerd bij diverse inflammatoire aandoeningen, zoals pneumonie29, artrose30, rhinitis31 en sepsis32. Onze resultaten komen overeen met die in deze studies gerapporteerd, waarbij de expressie van NEAT1 significant upgereguleerd is bij patiënten met IBS-D. Dit suggereert dat het geassocieerd kan zijn met het ontstaan van IBS-D. Momenteel is de diagnose van IBS-D primair gebaseerd op de Rome IV-symptoomcriteria, en zijn er geen objectieve laboratoriumbiomarkers beschikbaar. Hoewel deze criteria effectief zijn gebleken in onderzoek en in veel klinische settings, hebben ze nog steeds beperkingen, waaronder subjectiviteit, symptoomoverlap met andere ziekten en diagnostische vertragingen. Verdere ROC-curve-analyse geeft aan dat NEAT1 een relatief goede diagnostische waarde heeft bij patiënten met IBS-D. Serumexpressieniveaus van NEAT1 maken effectief onderscheid tussen IBS-D-patiënten en gezonde controles, met een AUC van 0,867 en een hoge sensitiviteit en specificiteit. Dit suggereert dat NEAT1 veelbelovend is als hulpmiddel om de Rome IV-criteria voor diagnose aan te vullen of als een nieuwe diagnostische marker voor IBS-D. Bijvoorbeeld, patiënten die zich presenteren met chronische abdominale pijn en veranderingen in de ontlastingsgewoonten en verhoogde NEAT1-niveaus hebben, kunnen met meer zekerheid worden geëvalueerd wanneer biomarkerresultaten samen met de Rome IV-criteria worden overwogen. Dit faciliteert de vroege start van symptoomgerichte behandeling en voorkomt onnodige invasieve onderzoeken. Omgekeerd is voor patiënten met normale biomarkerresultaten maar die wel voldoen aan de Rome IV-criteria nauwere monitoring gerechtvaardigd om andere organische ziekten uit te sluiten. Daarom wordt verwacht dat de integratie van deze biomarkers in de klinische praktijk de diagnostische nauwkeurigheid en efficiëntie zal verbeteren, hoewel prospectieve validatie in klinische settings nog vereist is.

De klinische symptomen die patiënten met IBS-D ervaren, kunnen gerelateerd zijn aan een verslechterde functie van de intestinale barrière33. Deze functie wordt primair gemedieerd door de tight junction (TJ)-structuur tussen intestinale epitheelcellen, waarbij ZO-1- en occludine-eiwitten belangrijke rollen spelen34,35. ZO-1 is betrokken bij het handhaven van de mechanische barrière en de permeabiliteit van het mucosale epitheel36. Occludine is hoofdzakelijk verantwoordelijk voor het vormen van tight junctions tussen cellen, die cruciaal zijn voor het behoud van hun barrièrefunctie37. Het tight junction-eiwit claudine-2 speelt, naast andere functies, een belangrijke rol bij het vormen van cel-bypass-porekanalen38. Bij patiënten met IBS-D zijn ZO-1 en occludine doorgaans verminderd, is claudine-2 verhoogd, is de intestinale barrière beschadigd en is de permeabiliteit verhoogd. Deze studie vond dat NEAT1-knockdown de TEER van het in vitro celmodel verhoogde, wat een beschadigend effect van NEAT1 op de intestinale barrière in dit model ondersteunt. Op moleculair niveau leidde het remmen van de NEAT1-expressie tot een significante rebound in de mRNA-expressieniveaus van de belangrijkste tight junction-eiwitten ZO-1 en occludine, terwijl de expressie van claudine-2 afnam. Dit suggereert dat NEAT1 de expressie van tight junction-eiwitten negatief kan reguleren, waardoor de fysieke barrière van het intestinale epitheel wordt verstoord en de permeabiliteit toeneemt. Uiteindelijk kan dit leiden tot het fenomeen van 'leaky gut'. Daarnaast is de laaggradige ontsteking die wijdverspreid is bij IBS-D een belangrijke factor die de barrièrebeschadiging verergert39. Talrijke studies hebben bevestigd dat lncRNA's kunnen fungeren als belangrijke regulatieknooppunten in inflammatoire signaleringspaden40. Ons onderzoek is hiermee consistent. Knockdown van NEAT1 vermindert significant de afgifte van de pro-inflammatoire cytokinen TNF-α, IL-6, IL-8 en IL-1β geïnduceerd door LPS. Dit is zeer vergelijkbaar met de rol van NEAT1 als een pro-inflammatoir lncRNA in andere ontstekingsmodellen, wat aangeeft dat er bij IBS-D mogelijk sprake is van een vicieuze cirkel van ontsteking-barrièrebeschadiging-ontsteking, waarin NEAT1 een belangrijke rol speelt.

Micro-RNA's (miRNA's) vormen een andere belangrijke klasse factoren die betrokken zijn bij ziekteregulatie. miR-29b-3p vertoont een lage expressie in diverse LPS-geïnduceerde cellulaire ontstekingsreacties41,42. In overeenstemming met de meeste studies stelden we vast dat de spiegels van miR-29b-3p opvallend verlaagd waren in het serum van IBS-D-patiënten en een sterke negatieve correlatie vertoonden met de upregulatie van NEAT1. We toonden verder aan dat NEAT1 in dit model direct bindt aan miR-29b-3p en dit in het cytoplasma wegvangt als een 'sponge'. Het functionele rescue-experiment toonde bovendien aan dat NEAT1 de viabiliteit en apoptose van Caco-2-cellen, evenals de mRNA-niveaus van ZO-1, occludine, en claudine-2 beïnvloedt, ten minste gedeeltelijk via miR-29b-3p, en uiteindelijk de integriteit van de darmbarrière beïnvloedt. Opvallend is dat onze gegevens aangeven dat, in de context van IBS-geassocieerde dysfunctie van de darmbarrière, de miR-29b-3p-spiegels positief correleren met de spiegels van ZO-1 en occludine. Deze positieve regulatie kan indirect zijn; zo kan miR-29b-3p de transcriptie van tight junction-eiwitten onderdrukken door hun transcriptionele repressoren te targeten, waardoor de repressie wordt opgeheven en de expressie van ZO-1 en occludine wordt bevorderd. Deze hypothese wordt ook ondersteund door eerdere studies, waarin werd gerapporteerd dat miR-29b-3p een beschermende rol speelt bij ontstekingstoestanden door negatieve regulatoren van de barrièrefunctie te targeten42.

De doelgenen via welke miR-29b-3p de mRNA-expressie van ZO-1 en occludine reguleert, vereisen echter verder onderzoek om het ceRNA-netwerk te completeren, wat een beperking is van onze huidige studie. Daarnaast kent onze studie andere beperkingen: Ten eerste was dit een single-center studie met een relatief kleine steekproefomvang (er waren slechts 116 IBS-D-patiënten geïncludeerd). De klinische diagnostische waarde van NEAT1 moet nog verder worden gevalideerd door middel van grootschalige, multicentrische prospectieve cohortstudies. Ten tweede is deze studie hoofdzakelijk gebaseerd op klinische associatieanalyse en in vitro celmodellen. In de toekomst zullen diermodellen nodig zijn om de rol van deze as in vivo te verifiëren. Ten derde is het specifieke downstream-doelgennetwerk van miR-29b-3p dat betrokken is bij de pathogenese van IBS-D nog niet volledig opgehelderd. Toekomstige studies zouden zich moeten richten op: (1) het valideren van de diagnostische waarde van NEAT1 en miR-29b-3p bij IBS-C- en IBS-M-patiënten; (2) het testen van de therapeutische effectiviteit van interventies gericht op NEAT1 in diermodellen; en (3) het ontrafelen van het precieze moleculaire mechanisme waarmee miR-29b-3p tight junction-eiwitten reguleert. Dergelijke inspanningen zullen de klinische vertaling van onze bevindingen faciliteren.

Concluderend wordt NEAT1 sterk tot expressie gebracht bij patiënten met IBS-D en heeft het een goede diagnostische waarde in deze cohort. Lage NEAT1-niveaus kunnen de cellevensvatbaarheid bevorderen, apoptose verminderen, beschadiging van de darmbarrière verlichten en ontstekingsreacties onderdrukken door de miR-29b-3p-niveaus in LPS-behandelde Caco-2-cellen te verhogen. De NEAT1/miR-29b-3p-as biedt een nieuw perspectief op de complexe pathofysiologische mechanismen van IBS-D. NEAT1 kan dienen als een potentiële diagnostische biomarker voor IBS-D, en de NEAT1/miR-29b-3p-as kan een potentieel therapeutisch doelwit voor deze aandoening vertegenwoordigen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling om te verklaren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24-wells platenCorningCLS3524Voor het uitplaten van cellen
96-wells platenCorningCLS3599Voor het uitplaten van cellen in CCK-8 assays
Annexine V-FITC/PI apoptosekitInvitrogenV13242Voor het detecteren van apoptosesnelheden
Anti-AGO2 monoklonaal antilichaamProteintech67934-1-IgVoor immunoprecipitatie van Ago2-gebonden RNA-complexen
Anti-Claudine-2 antilichaamInvitrogen32-5600Primair antilichaam, verdunning 1:1000
Anti-GAPDH antilichaamCell Signaling Technology5174Primair antilichaam, verdunning 1:5000; loading control
Anti-humaan IgG antilichaamProteintech10284-1-APGebruikt als negatieve controle voor RIP-assay
Anti-Occludine antilichaamAbcamab31721Primair antilichaam, verdunning 1:500
Anti-ZO-1 antilichaamProteintech21773-1-APPrimair antilichaam, verdunning 1:1000
Caco-2 cellenSUNNCELLSNL-068Voor het construeren van intestinale epitheliale barrièremodellen
CCK-8 kitSolarbioCA1210Kit voor celproliferatie-assay
ChloroformSigma-AldrichC2432Voor fasescheiding bij RNA-extractie
DMEM-mediumGibco11965092Voor celkweek
Dual-Luciferase Reporter Assay KitThermoFisher16186Voor het detecteren van luciferase-activiteit
ELISA-kit (voor IL-1β)R&D SystemsDY201Voor het detecteren van doelproteïnen in celkweeksupernatanten
ELISA-kit (voor IL-6)R&D SystemsD6050BVoor het detecteren van doelproteïnen in celkweeksupernatanten
ELISA-kit (voor IL-8)R&D SystemsNBP3-28022Voor het detecteren van doelproteïnen in celkweeksupernatanten
ELISA-kit (voor TNF-α)R&D SystemsDTA00DVoor het detecteren van doelproteïnen in celkweeksupernatanten
Enhanced chemiluminescence (ECL) substraatThermo Fisher32106Voor het visualiseren van proteïnebanden
Ethanol (75%)Sigma-Aldrich459844Voor het wassen van de RNA-pellet
FBS (foetaal runderserum)Gibco10099141Voor celkweek
FlowcytometerBeckman CoulterB53002Voor het detecteren van apoptosesnelheden
HRP-geconjugeerde secundaire antilichamenCell Signaling Technology7074Katalyseren de generatie van een chemiluminescent signaal vanuit ECL-substraten
IsopropanolSigma-Aldrich1133502500Voor RNA-precipitatie
Lipofectamine 3000ThermoFisherL3000015Transfectie-reagens
Lipopolysaccharide (LPS)Sigma-AldrichL2880Voor het induceren van celmodelconstructie
MicroplatenlezerBioTekEpoch 2Voor het detecteren van de absorbantie van monsters in 96-wells platen
Nanodrop micro-spectrofotometerThermo ScientificND-2000CVoor het bepalen van de RNA-concentratie en zuiverheid
Ontvatte gedroogde melkCoolaberCN7861Voor het blokkeren van membranen (5% oplossing)
PARIS KitThermo FisherAM1921Voor nucleair-cytoplasmatische fractionering
Penicilline–StreptomycineGibco15140122Voor resistentie tegen contaminatie tijdens celgroei
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher23225Voor het bepalen van proteïneconcentraties
pmirGLO Dual-Luciferase vectorPromegaE1330Dual luciferase reportergen-vector
PrimeScript RT Reagent KitTakaraRR047AVoor reverse transcriptie van RNA naar cDNA
PVDF-membraanMilliporeIPVH00010Voor proteïne-overdracht na SDS-PAGE
Real-time fluorescentie kwantitatief PCR-instrumentApplied Biosystems4365464Voor het detecteren van doelgenen
RIPA lysebuffer (met protease-remmers)Thermo Fisher89901Voor totale proteïne-extractie uit cellen
RNA-Binding Protein Immunoprecipitation KitSigma-Aldrich17-701RNA-Binding Protein Immunoprecipitatie (RIP) assay met Protein A/G magnetische beads
SDS-PAGE reagentia (10% gel)TargetMolC0189Voor het scheiden van proteïnen op basis van molecuulgewicht
SYBR Green mastermixThermo Fisher4309155Voor gebruik in PCR-testen
TEER-meter (Volt-Ohm Meter)MilliporeMERS00002Transmembraanweerstandsmeting, meet de integriteit van een enkele laag
Transwell-kamersCorning CostarCLS3413Voor het kweken van celmonolagen en het meten van TEER
TRIzol-reagensInvitrogen15596026CNVoor totale RNA-extractie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ren M, Ma J, Qu M. Network pharmacology integrated with molecular docking and molecular dynamics simulations to explore the mechanism of Shaoyao Gancao Tang in the treatment of asthma and irritable bowel syndrome. Medicine (Baltimore). 2024;103(50).
  2. Zhao C, Zhou X, Shi X. The influence of Nav1.9 channels on intestinal hyperpathia and dysmotility. Channels (Austin). 2023;17(1):2212350.
  3. Jiang J, et al. Effectiveness of Tong-Xie-Yao-Fang combined with Si-Ni-San for irritable bowel syndrome: a protocol for systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2021;100(11).
  4. Lenoir M, Wienke J, Fardao-Beyler F, Roese N. An 8-week course of Bifidobacterium longum 35624 is associated with a reduction in the symptoms of irritable bowel syndrome. Probiotics Antimicrob Proteins. 2025;17(1):315-27.
  5. Tao E, et al. Early life stress induces irritable bowel syndrome from childhood to adulthood in mice. Front Microbiol. 2023;14:1255525.
  6. Biswas S, et al. Expressions of serum lncRNAs in diabetic retinopathy: a potential diagnostic tool. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:851967.
  7. Li W, et al. Functional roles of non-coding RNAs in panvascular diseases. J Vis Exp. 2025;(226).
  8. Shin SY, et al. The effect of phloroglucinol in patients with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. J Neurogastroenterol Motil. 2020;26(1):117-27.
  9. Yang S, et al. Ginseng-derived nanoparticles alleviate inflammatory bowel disease via the TLR4/MAPK and p62/Nrf2/Keap1 pathways. J Nanobiotechnology. 2024;22(1):48.
  10. Zhang J, et al. Role of the gut microbiota in complications after ischemic stroke. Front Cell Infect Microbiol. 2024;14:1334581.
  11. Chen S, et al. The role of lncRNAs in regulating the intestinal mucosal mechanical barrier. Biomed Res Int. 2021;2021:2294942.
  12. Lu Q, et al. The role of long noncoding RNAs in intestinal health and diseases: a focus on the intestinal barrier. Biomolecules. 2023;13(11):1674.
  13. Li F, et al. Knockdown of long non-coding RNA NEAT1 relieves inflammation of ulcerative colitis by regulating the miR-603/FGF9 pathway. Exp Ther Med. 2022;23(2):131.
  14. Ni S, Liu Y, Zhong J, Shen Y. Inhibition of lncRNA NEAT1 alleviates intestinal epithelial cells dysfunction in ulcerative colitis by maintaining the homeostasis of the glucose metabolism through the miR-410-3p-LDHA axis. Bioengineered. 2022;13(4):8961-71.
  15. Aparicio P, et al. Serum lncRNAs NEAT1, PVT1 and H19 as novel biomarkers for sarcopenia diagnosis and treatment response. Noncoding RNA Res. 2025;14:166-76.
  16. Martínez C, et al. miR-16 and miR-125b are involved in barrier function dysregulation through the modulation of claudin-2 and cingulin expression in the jejunum in IBS with diarrhoea. Gut. 2017;66(9):1537-8.
  17. Che F, et al. Lnc NEAT1/miR-29b-3p/Sp1 form a positive feedback loop and modulate bortezomib resistance in human multiple myeloma cells. Eur J Pharmacol. 2021;891:173752.
  18. Zhang Y, et al. LncRNA NEAT1/miR-29b-3p/BMP1 axis promotes osteogenic differentiation in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Pathol Res Pract. 2019;215(3):525-31.
  19. Ludidi S, et al. The intestinal barrier in irritable bowel syndrome: subtype-specific effects of the systemic compartment in an in vitro model. PLoS One. 2015;10(5).
  20. Fan Z, et al. Investigation of the biomarkers and mechanism based on endoplasmic reticulum stress in irritable bowel syndrome. Arab J Gastroenterol. 2025;26(4):337-46.
  21. Zhang H, Xiong Z, He Y, Su H, Jiao Y. Cimifugin improves intestinal barrier dysfunction by upregulating SIRT1 to regulate the NRF2/HO-1 signaling pathway. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(3):2897-908.
  22. Zhang Y, et al. Decreased expression of microRNA-510 in intestinal tissue contributes to post-infectious irritable bowel syndrome via targeting PRDX1. Am J Transl Res. 2019;11(12):7385-97.
  23. Li BR, et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. J Vis Exp. 2018;(140).
  24. Zhang M, et al. The lncRNA NEAT1 activates Wnt/β-catenin signaling and promotes colorectal cancer progression via interacting with DDX5. J Hematol Oncol. 2018;11(1):113.
  25. Liang J, Liu C, Xu D, Xie K, Li A. LncRNA NEAT1 facilitates glioma progression via stabilizing PGK1. J Transl Med. 2022;20(1):80.
  26. Yu Q, et al. Silencing of lncRNA NEAT1 alleviates acute myocardial infarction by suppressing miR-450-5p/ACSL4-mediated ferroptosis. Exp Cell Res. 2024;442(2):114217.
  27. Gong Z, Zhang Y, Jiang Y, Chen P, Ji J. LncRNA NEAT1 targets miR-342-3p/CUL4B to inhibit the proliferation of cutaneous squamous cell carcinoma cells. J Oncol. 2022;2022:8145129.
  28. Han M, et al. LncRNA NEAT1 protects uremic toxin-induced intestinal epithelial barrier injury by regulating miR-122-5p/Occludin axis. PLoS One. 2025;20(5).
  29. Cui J, Wang J, Lv Y, Xu D. LncRNA NEAT1 regulates infantile pneumonia by sponging miR-146b. Mol Biotechnol. 2021;63(8):694-701.
  30. Xiao P, et al. LncRNA NEAT1 regulates chondrocyte proliferation and apoptosis via targeting miR-543/PLA2G4A axis. Hum Cell. 2021;34(1):60-75.
  31. Wu X, et al. Aberrant expressions of circulating lncRNA NEAT1 and microRNA-125a are linked with Th2 cells and symptom severity in pediatric allergic rhinitis. J Clin Lab Anal. 2022;36(3).
  32. Wang K, Liu Y, Chai Y. NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 axis regulates macrophage polarization and inflammation in sepsis models. J Vis Exp. 2026;(227).
  33. Tojo González R, et al. Síndrome de intestino irritable: papel de la microbiota y probióticos [Irritable bowel syndrome; gut microbiota and probiotic therapy]. Nutr Hosp. 2015;31(Suppl 1):83-8.
  34. Hwang HJ, et al. Ferulic acid as a protective antioxidant of human intestinal epithelial cells. Antioxidants (Basel). 2022;11(8):1448.
  35. Wu Y, et al. Probiotics (Lactobacillus plantarum HNU082) supplementation relieves ulcerative colitis by affecting intestinal barrier functions, immunity-related gene expression, gut microbiota, and metabolic pathways in mice. Microbiol Spectr. 2022;10(6).
  36. Kuo WT, et al. The tight junction protein ZO-1 is dispensable for barrier function but critical for effective mucosal repair. Gastroenterology. 2021;161(6):1924-39.
  37. Furuse M, et al. Occludin: a novel integral membrane protein localizing at tight junctions. J Cell Biol. 1993;123(6 Pt 2):1777-88.
  38. Wang Z, et al. Binding of Trichinella spiralis C-type lectin with syndecan-1 on intestinal epithelial cells mediates larval invasion of intestinal epithelium. Vet Res. 2023;54(1):86.
  39. Kaya İslamoğlu ZG, Unal M, Küçük A. Atopic dermatitis in adults and irritable bowel syndrome: a cross-sectional study. Indian J Dermatol. 2019;64(5):355-9.
  40. Ma C, et al. LncRNA PTS-1 protects against osteoarthritis through the miR-8085/E2F2 axis. J Inflamm Res. 2025;18:347-66.
  41. Tong Y, Zhou Z, Tang J, Feng Q. miR-29b-3p inhibits the inflammation injury in human umbilical vein endothelial cells by regulating SEC23A. Biochem Genet. 2022;60(6):2000-14.
  42. Li Z, et al. miR-29b-3p protects cardiomyocytes against endotoxin-induced apoptosis and inflammatory response through targeting FOXO3A. Cell Signal. 2020;74:109716.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

NEAT1 expressielipopolysaccharide schadeIBS D biomarkerRT qPCRcellevensvatbaarheidbarri reintegriteitapoptose assay

Gerelateerde artikelen