Een vormanalyse-algoritme kwantificeert de ruimtelijke morfologie en context van 2D- naar 3D-celkweek voor nieuwe kwantificatie van fenotypen

Samenvatting

Dit artikel legt uit hoe nieuwe morfologische kenmerken in cellen en organoïden kunnen worden gekwantificeerd met behulp van de linearized compressed polar coordinates (LCPC)-transformatie, een ruimtelijk algoritme dat eigenschappen vastlegt die traditionele metrieken zoals oppervlakte, volume en oppervlakte, niet kunnen. Best practices voor vormoriëntatie en uitlijning worden besproken.

Samenvatting

Talrijke studies hebben aangetoond dat het morfologisch fenotype van een cel of organoïde correleert met de vatbaarheid voor antikankermiddelen. Traditionele methoden om fenotype te meten zijn echter gebaseerd op ruimtelijke metrieken zoals oppervlakte, volume, omtrek en signaalintensiteit, die werken maar beperkt zijn. Deze benaderingen kunnen veel cruciale kenmerken van de ruimtelijke context niet meten, zoals chiraliteit, een eigenschap van links- en rechtshandigheid. Volume kan niet worden gebruikt om chiraliteit te registreren omdat de linker- en rechterschoenen hetzelfde volume hebben. Hoewel ruimtelijke context in de vorm van chiraliteit, zwaartekrachtrichting en polariteitsas intuïtief is voor mensen, kunnen de traditionele meetmethoden die tot nu toe door celbiologen, pathologen, radiologen en machine learning-praktijken worden gebruikt, deze fundamentele begrippen niet vastleggen. De linearized compressed polar coördinates (LCPC) transformatie is een nieuw algoritme dat ruimtelijke context kan vastleggen zoals geen enkele andere metriek. De LCPC-transformatie vertaalt een tweedimensionale (2D) contour naar een discrete sinusgolf door een rastersysteem over elkaar te leggen dat de snijpunten tussen de contour en de rasterlijnen volgt. Het verandert de contour in een reeks paren discrete coördinaten, waarbij de onafhankelijke coördinaat (x-coördinaat) overeenkomt met opeenvolgende posities in de 2D-ruimte. Elke afhankelijke coördinaat (y-coördinaat) bestaat uit de afstand tussen een snijpunt van de contour en de rasterlijn tot de oorsprong of basislijn van het rastersysteem. In de vorm van een discrete sinusoïde golf wordt vervolgens de Snelle Fouriertransformatie op de data toegepast. Op deze manier worden de vormen van cellen in 2D- en 3D-celkweek systematisch en multidimensionaal weergegeven, waardoor robuuste kwantitatieve stratificatie mogelijk wordt die inzicht geeft in therapieresistentie.

Inleiding

Driedimensionale (3D) organoïdecultuur is superieur gebleken aan tweedimensionale (2D) celkweek in het nabootsen van in vivo biologie ^1,2. Organoïden zijn onmisbaar geworden in kankeronderzoek voor screening op effectieve behandelingen en om inzicht te krijgen in de ziekteprogressie 3,4,5,6. Hoewel het in de kankerbiologie algemeen bekend is dat verschillen in morfologie correleren met verschillend biologisch gedrag van cellen en weefsels, is het vakgebied gebaseerd op traditionele vormmetingen die beperkt zijn in reikwijdte. Deze studie beschrijft een nieuw ruimtelijk algoritme dat subtiele morfologische kenmerken objectief kwantificeert met ongekende precisie, waarmee het traditionele benaderingen zoals oppervlakte, volume en oppervlakte overtreft.

De linearized compressed polar coördinates (LCPC) transformatie werd uitgevonden om objectief en kwantitatief complexe morfologieën te beschrijven die in de weefselhistopathologie worden waargenomen, met als doel de grading van colon polypen⁷ te verbeteren. De wens om deze aanpak vervolgens uit te breiden om macroscopische MRI-gebaseerde ruimtelijke kenmerken in hersenpathologieën zoals bipolaire stoornis en de ziekte van Alzheimer vast te leggen, leidde tot augmentaties die het nog verder versterkten. Deze studie beschrijft het stapsgewijze protocol en best practices voor het toepassen van twee versies van de LCPC-transformatie: het parallelle gridsysteem en het radiale gridsysteem, die beide open-source scripts en tutorialvideo's hebben.

Naast traditionele geometrische methoden bestaan er meerdere abstracties die effectief zijn geweest voor het meten van de complexe vormen van cellen en organen. Deze omvatten het meten van excentriciteit, scheefheid, contrast en kurtosis, samen met Zernike-momenten om circulariteit, asymmetrie, randonregelmatigheid en globale contourstructuur ^8,9,10 vast te leggen. Fractale analyse is ook nuttig geweest om complexe contouren te reduceren tot scalaire waarden, zoals Fractale Dimension, die meet hoe onregelmatig de contour is, en lacuniteit, die meet hoe heterogeen onregelmatige gaten in de contour^11,12 voorkomen. Voor het meten van textuur is de Gray Level Co-occurrence Matrix (GLCM) methode populair voor het meten van contrast, energie, homogeniteit, correlatie en entropie^13,14. Hoewel al deze methoden nuttig zijn, zijn ze niet ontworpen om ruimtelijke context vast te leggen, zoals de richting van de zwaartekracht, links- versus rechtshandigheid, of de locatie van de centrale steunstructuur die de richting van vormverandering beïnvloedt. Bovendien produceren veel van hen één enkele scalaire waarde of slechts een handvol scalairwaarden om ruimtelijke informatie weer te geven, waardoor de geciteerde studies ze vaak in combinatie gebruiken om complexe vormen te beoordelen.

De LCPC-transformatie is ontworpen om veel kenmerken uit één meting te produceren en om ruimtelijke markeringen toe te voegen die ruimtelijke context in de vorm coderen, zoals de richting van de zwaartekracht. De methode die het dichtst bij de LCPC-transformatie⁷ ligt, werd een jaar later^{gepubliceerd op 15}, met hetzelfde kernidee als uitgangspunt: de Fouriertransformatie toepassen op celcontouren om vorm te meten in de vorm van een frequentiespectrum. De LCPC-transformatie is echter onafhankelijk ontwikkeld om toegepast te worden via verschillende rastersystemen die bedoeld waren om samen met kennis van de ruimtelijke context buiten de gemeten vorm te worden gebruikt. Bovendien legt de uitvinder van de LCPC-transformatie in dit manuscript uit dat het resulterende frequentiespectrum enorme hoeveelheden verborgen ruimtelijke informatie bevat. Aanvullend Dossier 1 bevat een uitgebreide bespreking van ruimtelijke contexten in de biologie die vaak over het hoofd worden gezien bij het gebruik van de geciteerde methoden en hoe de LCPC-transformatie kan worden toegepast om deze context vast te leggen. Voor lezers van wie de vormgegevens geen verschil laten zien tussen controle- en experimentele groepen, of hun ogen nu verschil in de vormen kunnen zien, of van wie de vormgegevens nauwelijks verschil laten zien, ook al vermoeden ze dat er een groter verschil zou moeten zijn, moeten ze de LCPC-transformatie proberen.

De LCPC-transformatie biedt een ongekend niveau van precisie bij het meten van ruimtelijke informatie omdat het vormen in meerdere dimensies weergeeft. In tegenstelling tot traditionele methoden, zoals oppervlakte en volume, die slechts één scalaire waarde per vorm opleveren (d.w.z. 25 cm²), kunnen de resultaten van de LCPC-transformatie meerdere indices opleveren, die elk correleren met een ander morfologisch aspect van een vorm (d.w.z. rondheid versus scherpte van hoeken, gladheid versus scherpte van randen). De LCPC-transformatie beschrijft een 2D-vorm door een raster van rechte lijnen over elkaar te leggen die de contour snijden. Elk roostersysteem heeft een oorsprong (Figuur 1) of een basislijn (Figuur 2) van waaruit lineaire afstand gemeten kan worden. Zie Figuren 1B en 2B voor vereenvoudigde stroomdiagrammen die het algoritme beschrijven. Elk snijpunt tussen de rasterlijnen en de contour van de vorm wordt gedetecteerd. De afstand van elke doorsnede wordt vervolgens berekend ten opzichte van een basislijn of oorsprong. Op deze manier zet de LCPC-transformatie 2D-vormen om in een reeks opeenvolgende x-y coördinatenparen. De x-coördinaat geeft de positie van de rasterlijn van nul tot oneindig aan, terwijl de y-coördinaat de afstand van de snijpunt tot de basislijn of oorsprong weergeeft. In deze vorm, die een discrete sinusoïde golf is, wordt de Fast Fourier-transformatie (FFT) toegepast om de gegevens van het "positiedomein" naar het frequentiedomein om te zetten. Als de x-coördinaat tijd voorstelde, dan zou het "positiedomein" gelijkwaardig zijn aan het "tijddomein" in de standaardtoepassingen van de FFT.

Terwijl het radiale roostersysteem de afstand meet van elke snijpunt tot de oorsprong van het radiale rooster (Figuur 1A), meet het parallelle roostersysteem altijd de afstand van doorsneden met verwijzing naar een denkbeeldige lijn links van de vorm (Figuur 2A). Het open-source script bepaalt de positie van deze denkbeeldige lijn door de meest linkse pixel van de contour te vinden en vervolgens 10 pixels naar links van deze positie te verplaatsen. Hier wordt de x-coördinaat van deze positie de referentielijn waaruit alle doorsneden worden berekend. Deze 10-pixelregel is willekeurig, maar daarom moeten alle contouren die door het open-source script voor het parallelle grid-systeem worden geanalyseerd minstens 15 pixels witte ruimte aan alle vier de zijden bevatten.

Voor 2D-vormen met plooien of meerdere lagen kunnen rasterlijnen de contour meer dan eens snijden. In dit geval worden de afstanden van alle doorsneden langs een rasterlijn opgeteld tot één enkele waarde. Dus elke gridlijn heeft slechts één x-coördinaat en één y-coördinaat. Deze som wordt weergegeven door de term "gecomprimeerd" in de naam LCPC-transformatie. Het renderen van een niet-lineaire 2D-vorm in een discrete sinusgolf wordt weergegeven door de term "linearized" in de naam van het algoritme. Tot slot zit de term "polaire coördinaten" in de naam van het algoritme omdat het eerste gridsysteem dat werd bedacht een 180-graden radiaal raster was met polaire coördinaten⁷. Zelfs nadat men besefte dat polaire en cartesische coördinaten uitwisselbaar zijn, bleef de naam van het algoritme behouden. De sectie dankbetuigingen beschrijft de persoonlijke redenen die de uitvinding en uitbreiding van de LCPC-transformatie hebben gemotiveerd.

Protocol 1 was de volgorde voor het verkrijgen van de gegevens in Figuur 3B, terwijl Protocol 2 de volgorde was voor het verkrijgen van de gegevens in Figuur 3C–D. De stappen in deze protocollen zijn geïmplementeerd in individuele Python-scripts die beschikbaar zijn in de GitHub-repository "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶. Protocol 1 is een voorbeeld van de pre-processing stappen om "pure vorm" af te leiden ter voorbereiding op de LCPC-transformatie. Protocol 2 is een voorbeeld van pre-processing stappen om vormen "op schaal" te meten, wat betekent op hun oorspronkelijke schalen ten opzichte van elkaar.

Segmentatie kan handmatig worden uitgevoerd in beeldverwerkingssoftware, zoals Mac's Preview of Microsoft's Paint, of met behulp van drempelgebaseerde methoden. Als het handmatig wordt gedaan, moet een van de volgende vier kleuren worden gekozen: blauw, groen, roze/magenta of rood. De GitHub-repository genaamd "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶ bevat een map genaamd "color extraction scripts". Deze map bevat vier Jupyter Notebook-bestanden met Python-code die de vier eerder genoemde kleuren extraheren en omzetten in blauwe maskers op een witte achtergrond. Dit proces kan ook worden uitgevoerd door de omtrekkleur te drempelen in beeldverwerkingssoftware zoals Fiji/ImageJ. Voor afbeeldingen die contouren bevatten met aanrakende randen of overlappende randen (bijvoorbeeld een Venn-diagram), moeten ze worden gescheiden met behulp van beeldverwerkingssoftware, zodat ze onafhankelijke objecten worden in het samengestelde maskerbeeld met meerdere organoïde contouren. Dit geldt niet voor afbeeldingen die slechts één organoïde bevatten of meerdere organoïden die elkaar niet raken.

Protocol

Primaire menselijke cellen die in deze studie werden gebruikt, werden verkregen en gekweekt onder ethische goedkeuringen en procedures voor geïnformeerde toestemming, eerder gerapporteerd¹⁷. De hier gepresenteerde beelden zijn gegenereerd uit die goedgekeurde celculturen en worden voor het eerst gepubliceerd. Weefselmonsters werden verzameld in het Brigham and Women's Hospital en de University of California, San Francisco onder door de Institutional Review Board (IRB) goedgekeurde protocollen van patiënten die geïnformeerde toestemming gaven voor onderzoeksgebruik van hun weefsels, zoals eerder beschreven¹⁷. Er werd geen aanvullende menselijke monsterverzameling uitgevoerd voor deze studie.

1. Het extraheren van de pure vorm van 2D-organoïde contouren voor de LCPC-transformatie

1. Segmenteer de buitenrand van elke organoïde met behulp van elke beeldverwerkingssoftware, zoals Microsoft's Paint, MacOS' Preview of Fiji/ImageJ.
2. Haal de contouren van de organoïden uit als open maskers die blauwe lijnen zijn op een witte achtergrond.
3. Isoleer elke blauwe contour op een eigen wit canvas.
   OPMERKING: Deze stap is alleen nodig als een afbeelding meer dan één contour bevat.
4. Snijd elke contour bij zodat er een marge van één pixel aan alle vier de zijden van het blauwe object ontstaat.
5. Voeg 100 pixels witte ruimte toe aan alle vier de zijden om nieuwe marges te creëren.
6. Draai de objecten zodanig dat de langste interne lengte horizontaal is.
   OPMERKING: Deze stap verandert de langste interne lijn binnen elk object in de breedte van het object. Er zijn twee scripts beschikbaar voor dit doel. Voor gesloten vormen gebruik je het Jupyter Notebook genaamd "Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length_v2.ipynb". Voor open vormen of vormen met meerdere componenten, gebruik het Jupyter Notebook genaamd "Rotate Green Line_v3.ipynb". De Rotate Green Line-tool heeft een videotutorial die gekoppeld is in het ReadMe-bestand dat zich in dezelfde map bevindt als het .ipynb-bestand.
7. Snijd elke afbeelding bij zodat er een marge van één pixel aan alle vier de zijden van het blauwe object is.
   OPMERKING: Dit is hetzelfde als Stap 1.4. Het doel van het bijsnijden deze keer is echter dat de volgende stap in het formaat het hele canvas verkleint, niet alleen het blauwe object erin. Door het blauwe object bijna dezelfde breedte en hoogte te maken als het canvas zelf, wordt het canvas ook vergroot tot 400 pixels breed, waardoor het object bijna 400 pixels breed wordt. Er is een Jupyter Notebook genaamd "Trim margin to 1-pixel border.ipynb".
8. Verander de canvasbreedte van elke afbeelding naar 400 pixels breed terwijl je ook de beeldverhouding beperkt.
   OPMERKING: Deze stap zorgt ervoor dat elk object dezelfde breedte heeft. Het beperken van de beeldverhouding voorkomt scheeftrekken van het object tijdens het verkleinen van grootte. Er is een Jupyter Notebook genaamd "Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb".
9. Voeg 100 pixels witte ruimte toe aan alle vier de zijden om nieuwe marges te creëren.
10. Draai elke afbeelding 90 graden met de klok mee of tegen de klok in om de langste interne lengte verticaal te maken, consistent met de keuze voor alle beelden.
    OPMERKING: In bovenstaande volgorde wordt pure vorm verkregen door sequentieel de stappen 1.6, 1.7, 1.8 en 1.9 te implementeren. Het toevoegen van marginruimte in Stap 1.9 is nodig om fouten in de LCPC-transformatiescripts te voorkomen die als volgende worden uitgevoerd, maar die niet betrokken zijn bij het extraheren van de pure vorm. Gebruikers die vormen "op schaal" willen meten, hoeven de stappen 1.6, 1.7 en 1.8 in bovenstaande reeks niet uit te voeren, hoewel ze hun maskerafbeeldingen nog steeds moeten voorverwerken om optimale oriëntatie te bereiken voordat ze de LCPC-transformatie toepassen.
11. Voer de LCPC-transformatie uit op elke contour. Gebruik Python-scripts die zijn geleverd voor de radiale roostermethode¹⁸ of de parallelle roostermethode¹⁹.

2. Het extraheren van de schaalgrootte van 2D-organoïde contouren voor de LCPC-transformatie

OPMERKING: De stapsgewijze methode om de schaalvorm van objecten op schaal te extraheren lijkt op die voor het extraheren van pure vorm in Protocol 1 hierboven. De stappen zijn in beide protocollen identiek genoemd voor het gemak van matchen. Raadpleeg de aantekeningen in Protocol 1 voor elke stap. Het belangrijkste verschil tussen pure vorm en schaalgrootte vorm is dat schaalgrootte niet vereist stappen 1.6, 1.7 en 1.8, die de schaalaanpassingsstappen zijn.

1. Segmenteer de buitenrand van elk organoïde. Gebruik een computationele aanpak of doe dit handmatig via een eenvoudige beeldbewerkingssoftware, zoals Microsoft's Paint, MacOS' Preview of Fiji/ImageJ.
2. Haal de contouren van de organoïden eruit als open maskers die blauwe lijnen zijn op een wit doek. Gebruik Fiji/ImageJ om maskers te extraheren of het Python-script dat¹⁶ scripts heeft geleverd.
3. Isoleer elke blauwe contour op een eigen wit canvas. Gebruik Fiji/ImageJ om maskers te extraheren of het Python-script dat¹⁶ scripts heeft geleverd.
4. Snijd elke contour bij zodat er een marge van één pixel aan alle vier de zijden van het blauwe object ontstaat. Gebruik Fiji/ImageJ of het Python-script^{dat 16} heeft.
5. Voeg 100 pixels witte ruimte toe aan alle vier de zijden om nieuwe marges te creëren. Gebruik Fiji/ImageJ of het Python-script^{dat 16} heeft.
6. Draai elke contour zo dat de langste interne lijn verticaal is. Gebruik Fiji/ImageJ of het Python-script^{dat 16} heeft.
7. Voer de LCPC-transformatie uit op elke contour. Gebruik Python-scripts die zijn geleverd voor de radiale roostermethode¹⁸ of de parallelle roostermethode¹⁹.

Resultaten

De radiale grid LCPC-transformatie toegepast op borstkankerorganoïden

3D-organoïden en tumoren kunnen verschillende vormen aannemen, waarvan sommige duidelijk verschillen voor het menselijk oog, hoewel traditionele meetmethoden statistisch onbeduidende verschillen opleveren. Organoïden daarentegen kunnen ook vormen vertonen die heterogeen lijken en dus onbeduidend voor het menselijk oog, waardoor terugkerende subtiele morfologieën worden gemas...

Discussie

Zoals bij elk computationeel hulpmiddel hangt de kwaliteit van de output af van het feit of de input voldoet aan de verwachte regels waarop het gereedschap is ontworpen. De volgende regels moeten worden gevolgd en gebruikt worden als kwaliteitscontroles bij gebruik van de meegeleverde Python-scripts. Zorg er eerst voor dat de open maskers blauwe lijnen op een witte achtergrond zijn. Blue was een willekeurige beslissing en heeft geen betekenis, maar de scripts die de LCPC-transformatie ui...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Add 100 pixels to margins.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	Gebruikt de NearestNeighbors functie binnen het sklearn.neighbors pakket
BLUE_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	Gebruikt cKDTree functie binnen scipy.spatial pakket
Cliff's Delta	Tissue Spatial Geometrics Lab	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	Gemaakt een implementatie van Cliff's Delta via de Python taal
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Flip images VERTically.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
GREEN_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
MacOS Preview Version 11.0	Apple Inc	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Microsoft Paint	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	Werd vermeld als een potentieel nuttig hulpmiddel voor handmatige segmentatie, maar niet gebruikt in deze studie
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	Gebruikt de PCA functie met het sklearn.decomposition pakket
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate Green Line_v3.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CCW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Thicken Blue Lines.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Trim margin to 1-pixel border.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook