Protocol voor Tracking en Geautomatiseerde Gedragskwantificatie bij Drosophila melanogaster

Samenvatting

Dit protocol gebruikt poseschatting door Python om belangrijke lichaamspunten in gepaarde Drosophila te volgen, wat de geautomatiseerde kwantificering van subtiele sociale gedragingen faciliteert, vooral in sociale interactie, evenals heatmaps en bewegingsbanen.

Samenvatting

Om een open-source analytisch hulpmiddel te ontwikkelen dat de beperkingen van traditionele centroide-gebaseerde trackingmethoden overwint, presenteren we een protocol om sociale interacties in vrij handelende Drosophila-paren nauwkeurig te analyseren. Specifiek is dit protocol geïnspireerd op het high-resolution network (HRNet) framework om gelijktijdig vijf anatomische sleutelpunten te volgen—hoofd, borstborst, buik en linker- en rechtervleugeluiteinden—met als doel hogeresolutie coördinatengegevens te genereren voor latere kwantitatieve analyse van sociaal gedrag. Dit protocol biedt een complete workflow gebaseerd op Python en een grafische gebruikersinterface (GUI) die we hebben ontworpen, inclusief datasetconstructie, modeltraining en geautomatiseerde coördinatenextractie, samen met geïntegreerde modules voor het genereren van ruimtelijke bezettingsheatmaps, bewegingstrajecten en sociale interactieverhoudingen in vliegen. Om dit kader te valideren, werd het getest met behulp van twee veelgebruikte stammen, w1118 en Canton-S (CS). Onze resultaten toonden de stabiliteit van key-point detectie aan en toonden genotype-specifieke verschillen in ruimtelijk gebruik en locomotiefstructuur aan. Deze methodologie biedt een schaalbare basis voor kwantitatieve ethologie en geautomatiseerde analyse van sociale interacties in Drosophila, terwijl het handmatige annotatiewerk wordt verminderd en de reproduceerbaarheid verbetert.

Inleiding

Drosophila melanogaster is een veelgebruikt modelorganisme met krachtige genetische instrumenten en goed in kaart gebrachte neurale circuits die mechanistische^dissectie van gedrag mogelijk maken. Het heeft een breed scala aan sociale gedragingen, waaronder baltsmaken en agressie, en een sterk leervermogen 2,3,4,5,6,7,8. Elke eenheid bestaat uit verschillende motorische elementen die worden aangestuurd door een compact maar uiterst goed georganiseerd zenuwstelsel. Belangrijk is dat nauwkeurige meting van lichaamshouding essentieel is voor het begrijpen van de neurologische fundamenten van actiekeuze, omdat veel van deze gedragingen fijnkorrelige houdingsmotieven bevatten die contextuele en^{interne toestandsinformatie coderen.}

Ondanks de noodzaak van single-fly resolutie om individuele verschillen te detecteren, vertrouwen veel high-throughput gedragstests in Drosophila nog steeds op groepsniveau-indices¹¹. Gedragstests met hoge doorvoersnelheid omvatten T-maze-tests voor sociale voorkeur^12,13, sociale afstandsassays die afstand tussen vliegen kwantificeren, of aggregatie-/vermijdingsparadigma's onder sensorische stimulatie¹⁴ kunnen efficiënt populatietrends vastleggen. Ze houden echter inherent gepaard met gemiddelden tussen individuen, waardoor heterogeniteit in actiesequenties en de temporele structuur van sociale uitwisselingen wordt verhuld. Door de jaren heen hebben pogingen om naar per-vlieg identificatie te bewegen vertrouwd op functioneel beperkte methoden, zoals regelgebaseerde gebeurtenisdetectie met kinematische drempels, achtergrondaftrekking met centroidtracking en handmatige video-annotatie 15,16,17,18. Daardoor worden discrete gedragingen zoals uitvallen, tikken of dreigingen met de vleugel vaak genegeerd of verkeerd gelabeld, wat aanzienlijke handmatige correctie vereist. Dergelijke beperkingen hebben mechanistische studies beperkt die precieze temporele afstemming vereisen tussen neurale activiteit en individuele handelingen.

Dankzij recente ontwikkelingen in computer vision en op machine learning gebaseerde poseschatting is er nu een revolutionaire oplossing beschikbaar. Open-source frameworks zoals DeepLabCut¹⁹ en SLEAP²⁰ maken het mogelijk om lichaamsdelen zonder marker te detecteren, schaalbare classificatie van afzonderlijke acties en het behoud van individuele identiteit zelfs tijdens nauwe interacties mogelijk. Deze kenmerken overwinnen de nadelen van eerdere groepsgebaseerde en regelgestuurde benaderingen en maken herhaalbare kwantificering van complexe sociale gedragingen mogelijk.

Individuele interacties bij Drosophila worden gekenmerkt door unieke motorische kenmerken die wijzen op de voortgang van sociale interacties. Agressie omvat bijvoorbeeld typische gedragingen zoals uitvallen, dreigen met de vleugels en worstelen, die allemaal de groeiende conflictstadia^21,22 vertegenwoordigen. Baltsing wordt op vergelijkbare wijze gedefinieerd door oriëntatie, eenzijdige vleugelextensie met zangproductie, tikken en poging tot paring, die samenkomen om de temporele volgorde van paringsinteracties^{te vormen 23}. Het vastleggen van deze motieven is afhankelijk van nauwkeurige herkenning van lichaamshouding en gewrichtsbewegingen^24,25. In de praktijk vereist bemonstering een hoge ruimtelijke en temporele resolutie over langere opnameperiodes om ervoor te zorgen dat subtiele motorische patronen nauwkeurig kunnen worden gedetecteerd en afgestemd op neurale activiteit^25,26.

Hier presenteren we een open-source, visie-gebaseerd kader voor geautomatiseerde identificatie van vijf anatomische sleutelpunten—hoofd, borstkas, buik, linker- en rechteruiteinden²⁷. Het systeem omvat een volledige workflow voor datasetconstructie, modeltraining en coördinatenextractie, en levert hoogresolutie tijdreeksgegevens die geschikt zijn voor aanpasbare gedragsclassificatie. Door handmatige annotatieprocessen te automatiseren en analytische workflows te standaardiseren, maakt onze methode een fijne kwantitatieve analyse van sociale interactiegedragingen mogelijk, wat de efficiëntie en reproduceerbaarheid verhoogt en de tijd en arbeid die nodig is aanzienlijk vermindert.

Om de betrouwbaarheid van het systeem te valideren, pasten we het toe op twee veelgebruikte laboratoriumstammen, w1118 en Canton-S (CS), en observeerden we stabiele key-point detectie over frames, evenals genotype-specifieke verschillen in ruimtelijke bezetting, trajectkenmerken en sociale interactie-indicatoren op basis van hoofdafstand en oriëntatiehoek. Onderzoekers kunnen de geschiktheid van dit protocol beoordelen op basis van de vereiste ruimtelijke en temporele resolutie (≥30 fps, ≤0,5 mm/pixel) en videoopnamecondities (verlichting en contrast). De pixelgrootte kan direct worden bepaald aan de hand van de camera-instellingen. Een fruitvlieg met een gemeten lichaamslengte kan in het beeldgebied worden geplaatst voor kalibratie. Dit protocol is bijzonder geschikt voor de volgende scenario's: het gelijktijdig volgen van twee vrij interacterende Drosophila en het onderscheiden van hun individuele identiteiten; met focus op fijne houdingen (bijv. hoofdhoek en afstand) in plaats van alleen op de zwaartepuntposities; opnameduur van meer dan 10 minuten waar handmatig annoteren niet haalbaar is; wat milliseconde-niveau temporele uitlijning vereist tussen gedragsgebeurtenissen en neurale activiteit (bijv. calciumbeeldvorming of elektrofysiologie) in latere analyses.

Protocol

1. Vliegvoorbereiding

1. Verzamel en beproef de vliegen van ongeveer 3–4 dagen oud onder korte CO₂-anesthesie voordat ze experimenteren.
   OPMERKING: De duur van de anesthesie en de CO₂-debiet kunnen variëren afhankelijk van de specificaties en druk van de kooldioxidecilinder die in elk laboratorium wordt gebruikt. Vliegen moeten continu worden gemonitord tijdens de narcose, en de CO₂-blootstelling moet alleen worden gehandhaafd totdat de vliegen volledig onder narcose zijn en volledig stoppen met bewegen.
2. Plaats elke vlieg afzonderlijk in een 50 mL Falcon-buis met standaard maïsmeel-agar-glucose-gist medium.
3. Houd de vliegen op 25 °C tijdens een licht/donker cyclus van 12 uur tot gebruik.

2. Arena-bouw

1. Bereid twee transparante acrylplaten van 3 mm en één polyethyleenplaat van 3 mm voor.
2. Snijd vier ronde kamers (elk 35 mm diameter) in het midden van de polyethyleenplaat.
3. Gebruik clips om één acrylplaat aan de polyethyleenplaat te verbinden om de kamerbasis te vormen; Houd de tweede acrylplaat als afneembare afdekking.

Figuur 1: Schema van de gedragsarena en beeldvormingsopstelling. (A) De bouw van een op maat gemaakte observatiekamer is afgebeeld in het diagram. De kamer bestaat uit drie hoofdlagen: een 3 mm transparante acrylbasisplaat; een 3 mm polyethyleen plaat met vier cirkelvormige uitsparingen van 35 mm diameter die dienen als individuele kamerputten; en een tweede acrylplaat die als afneembare afdekking fungeert. (B) Een 90° adapterklem wordt gebruikt om de camera verticaal op een 40 cm optische paal te plaatsen. Voor top-down beeldvorming wordt de camera direct boven de meerlaagse observatiearena geplaatst, met zijn optische as loodrecht op het kameroppervlak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Beeldvorming opstellen

1. Zet twee optische palen van 20 cm en één paal van 40 cm samen met 90° adapterklemmen.
2. Plaats de camera (1280 × 1024 pixels) verticaal op de 40 cm lange paal, loodrecht op het arena-oppervlak, en stel de framerate in op 150 fps.
3. Plaats de arena op een 25 cm × 25 cm dimbaar daglicht-wit LED-paneel bedekt met een diffusieplaat.
4. Stel de verlichting bij op ongeveer 1500 lux op het arena-oppervlak.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de vleugelranden zichtbaar blijven in binaire preview. Vermijd >2000 lux om hitte-geïnduceerde artefacten te voorkomen, aangezien vliegen hun natuurlijke voortbeweging of verdeling kunnen veranderen door thermische stress van de lichtbron.

4. Opnameprocedure

1. Plaats 3 cm schuimpads onder elke hoek van de arena om deze te stabiliseren.
2. Vliegparen onder CO₂-anesthesie overbrengen naar kamers; Sluit af met de bovenste acrylplaat.
3. Laat de vliegen 40 minuten acclimatiseren voordat je opneemt.
4. Start video-opname met MIAS.exe²⁷: druk op q om te beginnen en c om te stoppen.
   OPMERKING: Dit resulteert in continue video-opnames van vrij interacterende vliegenparen onder gestandaardiseerde omstandigheden.

5. Definieer het sociale activiteitenpaneel

1. Voer het preprocessing-script uit: python SoAL_PreProcess.py [video_file_path]
   OPMERKING: Alle codeerscripts zijn beschikbaar in Aanvullend Bestand 1.
2. Annoteer het kamergebied en wijs metadata toe in de vorm van Genotype_age (dagen) × 1 (aantal kamers). (bijv. CS_3 × 1)
3. Pas de detectiedrempelschuif aan totdat de vleugels bijna onzichtbaar zijn in het binaire beeld om optimale achtergrondsubtractie en vleugelzichtbaarheid te garanderen.

6. Datasetvoorbereiding

1. Maak een nieuwe datasetmap aan door het volgende te draaien:
   python tools/SoAL_DatasetGen.py DATASETNAAM 10 (frame sampling interval)
   OPMERKING: De parameter van het frame sampling interval ("10") is aangepast van een eerder gepubliceerd protocol²⁷. Lagere waarden verhogen de bemonsteringsdichtheid en de rekenkracht, terwijl hogere waarden de rekenbehoefte verminderen en kunnen worden aangepast op basis van beschikbare hardwareprestaties en experimentele eisen.
2. Stel videopad en datasetpad in in 'tools/SoAL_DatasetUtils.py'
3. Start handmatig labelinterface:
   >python tools/SoAL_LabelUI.py DATASETNAME
   1. Framenavigatie: Druk op de spatie- of Z-toets om respectievelijk naar het volgende of vorige frame te navigeren. Of gebruik de tijdlijnschuif voor navigatie.
   2. Sleutelpuntlabeling: Klik op de juiste positie van een vlieg in elke afbeelding (in een specifieke volgorde: kop, borststuk, buik, linkervleugel en rechtervleugel) om de 5 sleutelpunten aan te geven.
   3. Sleutelpuntselectie: Druk op de cijfertoetsen om een sleutelpunt te kiezen (aangegeven door een witte cirkel). De volgende klik wijst een nieuw nummer toe aan het geselecteerde toetspunt.
   4. Opslaan: Sluit het venster of druk op de D-toets om de annotatieresultaten op te slaan.
      OPMERKING: Een volledig trainingssetarchief bestaat uit twee componenten: een afbeeldingsmap en een annotation.json bestand.

7. Modeltraining

1. Verdeel de dataset in trainings- en validatiesets:
   Python tools/SoAL_DatasetGen.py DATASETNAME scheiding
   Er worden twee nieuwe mappen aangemaakt in 'dataset/.'
2. Configureer trainingsparameters in hrnet/fly_w32.yaml:
   Rotatiefactor: 15°
   Schaalfactor: 0,35
   Helderheidsfactor: 0,25
   Batchgrootte: 24
   Tijdperken: 200
3. Voer het trainingsprogramma uit:
   python hrnet/tools/train.py --cfg hrnet/fly_w32.yaml
   Beëindig trainingssets wanneer gemiddelde precisie (AP) een plateau bereikt; behoud het beste model (AP > 90%).
4. Valideer het model met behulp van:
   python hrnet/tools/test.py --cfg hrnet/fly_w32.yaml
   Resultaat: Robuust HRNet-gebaseerd model voor multi-fly key-point detectie.

8. Voer het detectieprogramma uit

1. Kopieer nieuwe videobestanden naar de videomap.
2. Annoteer metadata zoals weergegeven in stap 5.
3. Voer detectieprogramma uit: python SoAL_KptDetect.py alles
4. Inspecteer detectieresultaten:
   Python tools/SoAL_ViewKptUI.py excel_file_path (.cvs/xslx)
   Resultaat: Tweedimensionale coördinaten van vijf anatomische herkenningspunten per vlieg over frames.

9. Gedragskwantificering

1. Start een zelfstandige GUI-applicatie voor analyse (Supplementary File 2) en importeer coördinatenbestanden in de interface.
2. Genereer heatmaps voor ruimtelijke bezetting (waarschijnlijkheidsdichtheid van arena-posities).
3. Reconstrueer de bewegingsbanen uit coördinatentijdreeksen.
4. Maak gegevens over sociale interactie, waaronder hoofdafstand, oriëntatie en afgeleide sociale toestand.
   Resultaat: Gestandaardiseerde visualisatie van genotype-specifiek ruimtelijk gebruik en bewegingsdynamiek.

Resultaten

Figuur 1 illustreert de arena-geometrie, verlichtingsconfiguratie en cameraplaatsing die worden gebruikt om natuurlijke sociale interacties in Drosophila vast te leggen. De opstelling zorgt voor uniforme verlichting en stabiele beeldomstandigheden die geschikt zijn voor pose-schatting en coördinatenextractie.

Geautomatiseerde houdingsschatting werd toegepast op alle opgenomen video's om tweedimensionale coördinaten te ext...

Discussie

Onze studie toont aan dat op machine learning gebaseerde houdingsschatting een schaalbare, betrouwbare methode biedt om fijnmazige sociale interacties in Drosophila te meten. Het overwint de beperkingen van centroide-gebaseerde benaderingen 15,16,17,18 door vijf anatomische sleutelpunten in vrij interacterende paren te volgen, waardoor hoekinformatie via de lichaamsas en de kop-tot-hoofd afstand, afgeleid uit hoofdpunten, kan worden verworven.<...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agar	BioFroxx	8211GR500
camera(MV-CU013-A0UC)	Hikvision	MV-CU013-A0UC
Koolstofdioxide	Messer	124-38-9
D(+)-Glucose watervrij	BioFroxx	1179GR500
Drosophila Small Vials (Falcon buis)	Biolgix	51-0500
Ethanol	Chron Chemicals	64-17-5
LED paneel	/	/	op maat gemaakt
Methylparabeen	Sigma	99-76-3
polyethyleen plaat	/	/	op maat gemaakt
Python	/	versie 3.6
Sucrose	DaMao	57-50-1
transparante acryl platen	/	/	op maat gemaakt
Gist	Angel	100004237033