Deze studie identificeerde acht potentiële geneesmiddeldoelen voor hartfalen via genetische analyse en onderzocht kandidaat-therapeutische verbindingen die met deze geïdentificeerde doelwitten geassocieerd zijn.
Onderzoeksartikel
Deze studie identificeerde acht potentiële geneesmiddeldoelen voor hartfalen via genetische analyse en onderzocht kandidaat-therapeutische verbindingen die met deze geïdentificeerde doelwitten geassocieerd zijn.
Hartfalen (HF) is een veelvoorkomende hart- en vaatziekte die de kwaliteit van leven in gevorderde stadia aanzienlijk aantast. Ondanks verschillende huidige behandelstrategieën blijft de ziektelast van HF aanzienlijk. Daarom is het dringend nodig om nieuwe therapeutische doelen te verkennen. Deze studie maakte gebruik van Mendeliaanse randomisatie (MR) om de causale relaties tussen drugbare genen en HF te evalueren. Colocalisatieanalyse en samenvattende data-gebaseerde Mendeliaanse randomisatie (SMR) werden uitgevoerd om de relatie tussen deze genen verder te valideren. Ten slotte werden 8 potentiële therapeutische doelwitten voor HF geïdentificeerd, waaronder 4 risicofactoren (CYP11A1, GALT, KCNH2 en METRN) en 4 beschermende factoren (APOM, CHD4, IL11RA en LPAR5). De analyse van het GO-verrijking, KEGG-verrijking en het eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerkanalyse gaf aan dat deze genen voornamelijk betrokken waren bij metabole regulatie en cardio-elektrofysiologische processen. Bovendien werden potentiële geneesmiddelen die deze doelwitten targeten geïdentificeerd met behulp van medicijnvoorspelling en moleculaire koppeling, waaronder mitotane, Adehl, Benzofuranen, 1,3-Di-o-tolylguanidine, 96-69-5 en bromoenollacton. Bovendien toonden PCR-resultaten ook aan dat mitotane mogelijk geassocieerd is met CYP11A1 en KCNH2. Geneesmiddelen die op basis van deze potentiële therapeutische doelen zijn ontworpen, kunnen hogere succespercentages bieden en de klinische uitkomsten verbeteren.
Hartfalen (HF) is een veelvoorkomend cardiovasculair syndroom dat wordt gekenmerkt door een verstoorde ventrikelvulling of myocardcontractiliteit, wat resulteert in onvoldoende hartminuutvolume om aan de metabole eisente voldoen 1,2,3. Klinisch wordt HF gekenmerkt door pulmonale en systemische congestie, weefselhypoperfusie en symptomen zoals dyspneu, vermoeidheid en perifere oedeem 1,4,5. Ondanks therapeutische vooruitgang blijft HF wereldwijd een toonaangevende oorzaak van morbiditeit en mortaliteit, met meer dan 64 miljoen mensen volgens de Global Burden of Disease (GBD)-studie 6,7,8. De aanzienlijke ziektelast onderstreept de dringende behoefte aan nieuwe therapeutische strategieën.
Huidige farmacologische en apparaatgebaseerde interventies voor HF worden beperkt door suboptimale effectiviteit en bijwerkingen, wat bijdraagt aan aanhoudend hoge heropnamecijfers en een verminderde kwaliteit van leven 9,10,11,12. Het identificeren van nieuwe moleculaire doelwitten met causale verbanden met HF-pathogenese is daarom cruciaal voor het verbeteren van klinische uitkomsten. Het integreren van genomica in geneesmiddelenontdekking is een zeer effectieve strategie om de efficiëntie te verbeteren, aangezien genetisch gevalideerde therapieën een significant hoger succespercentage laten zien in klinische onderzoeken 13,14,15. Bovendien dienen eiwitten die door deze actieve genen worden gecodeerd als primaire therapeutische doelwitten voor zowel kleine moleculen als monoklonale antilichamen16,17.
Recente vooruitgang in de menselijke genetica heeft het prioriteren van geneesmiddeldoelen vergemakkelijkt door integratieve analyse van genoom-brede associatiestudies (GWAS) en expression quantitative trait loci (eQTL) data. Mendeliaanse randomisatie (MR) maakt gebruik van genetische varianten als instrumentele variabelen om causale effecten te schatten, waarbij confounding en omgekeerde causaliteit die inherent zijn aan observationele studiesworden geminimaliseerd 13,14. In combinatie met colocalisatie en samenvattingsgebaseerde MR (SMR) maakt deze aanpak robuuste prioritering mogelijk van genen waarvan de modulatie het ziekterisico kan beïnvloeden, en biedt het een genetisch verankerde strategie voor doelontdekking 18,19,20. In vergelijking met conventionele associatiestudies overwint het integreren van MR, SMR en colocalisatie confounding en reverse causaliteit om robuuste causale inferenties te vestigen. Bovendien filtert dit kader vals-positieve signalen uit koppelingsdisequilibrium door ervoor te zorgen dat genexpressie en risico op hartfalen dezelfde onderliggende causale variant delen, waardoor de prioriteit van het doel wordt geoptimaliseerd. Het is vermeldenswaard dat hoewel cardiovasculair weefsel een hoge specificiteit vertonen, deze studie voornamelijk grootschalige cis-eQTL-gegevens van bloed gebruikt om de statistische kracht te maximaliseren. Hoewel deze aanpak mogelijk niet volledig de weefselspecifieke mechanismen van HF omvat, dienen bloedafgeleide varianten als toegankelijke biomarkers en bieden ze robuuste inzichten in systemische genetische oorzaken van de ziekte.
In deze studie werden grootschalige GWAS- en eQTL-datasets gebruikt om de causale effecten van medicijnbare genen op het HF-risico te evalueren. Significante verbanden werden verder gevalideerd door colocalisatie- en SMR-analyses. Om de biologische functies van geprioriteerde doelwitten te verduidelijken, werden Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verrijkingsanalyses uitgevoerd, samen met eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerkanalyses. Het therapeutisch potentieel werd vervolgens beoordeeld door middel van medicijnvoorspelling en moleculaire koppeling. Ten slotte werden de verbanden tussen geselecteerde geneeskrachtige genen en kandidaatgeneesmiddelen gevalideerd via in vitro experimenten.
Samenvattend biedt deze studie belangrijke inzichten voor de ontdekking van nieuwe therapeutische doelwitten voor HS. Door gebruik te maken van MR, SMR, colocalisatieanalyse, genverrijkingsanalyse, PPI-netwerkconstructie, geneesmiddelvoorspelling, moleculaire koppeling en in vitro-experimenten , kunnen deze bevindingen bijdragen aan de ontwikkeling van effectievere therapeutische strategieën voor HF.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Alle datasets die in deze studie zijn gebruikt, zijn verkregen uit eerder gepubliceerde studies met ethische goedkeuring. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.
1. Studieontwerp
De workflow van deze studie wordt geïllustreerd in Figuur 1. Ten eerste werden blootstellingsgegevens verkregen van de cis-eQTL's van drugbare genen. Ten tweede werd MR-analyse uitgevoerd om de causale relatie tussen drugbare genen en HF te onderzoeken. Kandidaat-therapeutische doelen voor HF werden vervolgens geïdentificeerd door colocalisatie- en SMR-analyses. Genverrijkingsanalyse en de opbouw van een PPI-netwerk werden vervolgens uitgevoerd. Ten slotte werden medicijnvoorspelling en moleculaire koppeling uitgevoerd om de affiniteit van geneesmiddelen voor genen te onderzoeken.
2. Gegevensbron
In totaal werden 6.888 drugbare genen geïdentificeerd uit twee bronnen. Eén dataset bevatte 4.463 genen uit een eerder gepubliceerde studie die meerdere databronnen integreerde17. De andere dataset bevatte 5.012 genen uit de Drug-Gene Interaction Database (DGIdb)21. Gedetailleerde informatie werd geïllustreerd op de website (https://www.dgidb.org/). Na het samenvoegen en verwijderen van duplicaten werden 6.888 unieke drogbare genen behouden voor analyse.
Cis-eQTL-gegevens zijn verkregen van het eQTLGen Consortium (https://eqtlgen.org/cis-eqtls.html), dat expressieprofielen bevat van 31.684 bloedmonsters en 16.987 genen omvat.
HF-samenvattende statistieken werden verkregen uit de R12-release van de FinnGen-database23, die 37.653 gevallen en 462.695 controles bevatte. De diagnose van HF was gebaseerd op de International Classification of Diseases (ICD), waaronder ICD-10—I11.0, I13.0, I13.2, I50, ICD-9—4029B|428, en ICD-8—42700|42710|428|7824. Alle deelnemers waren van Europese afkomst. Gedetailleerde informatie is beschikbaar op de FinnGen-website en het originele artikel (https://www.finngen.fi/en/access_results).
3. Mendeliaanse randomisatieanalyse
Instrumentele variabelen (IV's) werden geselecteerd op basis van drie kernaannames van MR.24. Ten eerste zijn IV's direct geassocieerd met blootstellingsfactoren. Ten tweede zijn IV's niet geassocieerd met verstorende factoren. Ten slotte beïnvloeden IV's de uitkomst alleen door blootstelling. Aangezien proximale eQTL's een directere en robuustere regulatoire controle uitoefenen over doelgenen, gebruikte MR uitsluitend SNP's die zich binnen 100 kb-gebieden van de genen bevinden om de biologische nabijheid te maximaliseren. Voor de SNP-selectie werden strikte criteria gehanteerd. Alle geselecteerde SNP's bevonden zich binnen 100 kb stroomopwaarts van de transcriptiestartplaats en 100 kb stroomafwaarts van de transcriptieeindplaats van elk duggbaar gen. Alleen SNP's met genoombrede significantie (p < 5×10-8) werden opgenomen25. Om het linkage-disequilibrium (LD) te minimaliseren, werd LD-klontering uitgevoerd met eenr2-drempel van 0,001 en een klontafstand van 10.000 kb26. SNP's met F-statistieken >10 werden behouden, berekend met de formule: F = [R2(N−k−1)]/[k(1−R2)]27. SNP-informatie is opgenomen in Aanvullende Tabel 1.
De primaire analytische methoden waren inverse variantie-gewogen (IVW) en Wald-ratio. Een p-waarde van minder dan 0,05 werd als statistisch significantbeschouwd 28,29. False discovery rate (FDR) werd toegepast om de p-waarde aan te passen en zo vals-positieve resultaten te minimaliseren30. Wanneer er slechts één SNP beschikbaar was, werd de Wald-ratiomethode gebruikt; anders werd IVW toegepast. De analyses omvatten MR-Egger, gewogen mediaan, gewogen modus en eenvoudige modus wanneer er voldoende SNP's aanwezig waren.
De Q-test van Cochran en MR-Egger intercept-analyse werden gebruikt om heterogeniteit en pleiotropie te testen. Een Q-p-waarde groter dan 0,05 duidde op de afwezigheid van heterogeniteit31. Een p-waarde voor het MR-Egger-intercept kleiner dan 0,05 gaf de aanwezigheid van directionele pleiotropie18 aan. Ten slotte werd de leave-one-out-test uitgevoerd om te testen of de resultaten beïnvloed konden worden door één enkele SNP. MR-analyses werden uitgevoerd met het TwoSampleMR-pakket (versie 0.6.11) in R (versie 4.4.2).
4. Colocalisatieanalyse
Colocalisatieanalyse werd uitgevoerd met het coloc R-pakket (versie 6.0.1) om te bepalen of gedeelde genetische varianten zowel genexpressie als HF-risico32 beïnvloedden. Eerdere waarschijnlijkheden dat een SNP aan een van beide eigenschappen en beide eigenschappen geassocieerd was, werden respectievelijk ingesteld op 1 × 10-4 en 1 × 10-5. De posterior kansen van de vijf hypothesen kunnen worden berekend: (1) PPH0: SNP's zijn niet gekoppeld aan twee eigenschappen. (2) PPH1/PPH2: SNP's zijn geassocieerd met genexpressie of HF. (3) PPH3: SNP's zijn gekoppeld aan HF en genexpressie, maar worden aangedreven door verschillende SNP's. (4) PPH4: SNP's zijn verbonden met HF en genexpressie, en worden aangestuurd door de gemeenschappelijke SNP's. Een PPH4 > 0,8 werd beschouwd als bewijs voor colocalisatie.
5. SMR-analyse
De SMR-analyse werd uitgevoerd om de relatie tussen het gen en HF te onderzoeken met behulp van de SMR-software (versie 1.3.1)33. De heterogeniteit in afhankelijke instrumenten (HEIDI) test werd uitgevoerd om te bepalen of waargenomen associaties te wijten waren aan koppelingen. Een significante SMR-p-waarde (< 0,05) gecombineerd met een HEIDI-p-waarde > 0,05 werd geïnterpreteerd als bewijs dat een echte causale relatie ondersteunt in plaats van een koppelingscenario-veroorzaakte associatie. De gedetailleerde operationele protocollen en computationele instellingen zijn te vinden op de officiële website.
6. Verrijkingsanalyse
GO- en KEGG-verrijkingsanalyses werden gebruikt om de biologische functies en routes van de gescreende potentiële therapeutische doelgenen34 te karakteriseren. GO-verrijking omvatte biologische processen (BP), moleculaire functies (MF) en cellulaire componenten (CC). Het R-pakket clusterProfiler (versie 4.14.6) en Pathview (versie 1.46.0) werden gebruikt om de verrijkingsanalyse35,36 uit te voeren.
7. Voorspelling van kandidaatgeneesmiddelen
Om potentiële therapeutische verbindingen te identificeren, werd geneesmiddelvoorspellingsanalyse uitgevoerd met behulp van de Drug Signatures Database (DSigDB) (http://dsigdb.tanlab.org/DSigD Bv1.0/)37. 22.527 gensets zijn opgenomen in de DSigDB, waaronder 17.389 unieke verbindingen die 19.531 genen beslaan. Associaties tussen kandidaatgenen en verbindingen werden geanalyseerd, gevolgd door verrijkingsanalyse om mogelijk relevante geneesmiddelen te identificeren die HF-geassocieerde genen targeten.
8. Constructie van eiwitinteractienetwerken
Eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerken zijn geconstrueerd met behulp van GeneMANIA (https://genem ania.org/)38. GeneMANIA zou kunnen helpen bij het genereren van genfunctiehypothesen, het analyseren van genenlijsten en het prioriteren van genen voor functioneel testen.
9. Moleculaire koppeling
Moleculaire koppeling werd uitgevoerd om de drugability van de genen en hun relatie met de geneesmiddelkandidaten te valideren. Docking-simulaties helpen de bindingsaffiniteit en interactiepatronen tussen verbindingen en doeleiwitten te beoordelen, waardoor kandidaatprioriteiten en optimalisaties worden geïnformeerd. Eiwitstructuren werden opgehaald uit de Protein Data Bank (PDB) (http://www.rcsb.org/), en verbindingsstructuren werden verkregen uit PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)39. Het koppelen werd uitgevoerd met CB-Dock2 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php), dat cavity detection gebruikt om blind docking40,41 te sturen. Gedetailleerde bedieningsprocedures en informatie over berekeningsinstellingen zijn te vinden op de officiële website.
10. Celkweek
Menselijke geïmmortaliseerde cardiomyocytencellen (AC16) werden gekweekt in AC16 celspecifiek kweekmedium onder steriele omstandigheden. De cellen werden op 37 °C gehouden in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Het kweekmedium werd elke 2–3 dagen vervangen en de cellen werden bij ongeveer 70%–80% confluentie doorgevoerd om optimale groeiomstandigheden te behouden. Cellenmorfologie en samenvloeiing werden routinematig gemonitord met lichtmicroscopie voor elk experiment. Alle celkweekprocedures werden uitgevoerd in een bioveiligheidskast om het risico op besmetting te minimaliseren. Voor behandelingsexperimenten werden AC16-cellen in 6-well platen geplant en een nacht gehecht voordat de behandeling werd toegediend.
11. Kwantitatieve omgekeerde transcriptie PCR (RT-PCR)
AC16-cellen werden behandeld met 200 μM palmitinezuur (PA) of 20 μM mitotane gedurende 24 uur na het bereiken van ongeveer 60%–70% confluentie. PA werd opgelost in runderserumalbumine (BSA), terwijl mitotane werd opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO). Alle potentieel gevaarlijke reagentia werden behandeld volgens standaard laboratoriumveiligheidsprocedures met passende persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen en laboratoriumjassen.
Na de behandeling werd het totale RNA gewonnen met een RNA-extractiekit volgens de instructies van de fabrikant onder RNase-vrije omstandigheden. RNA-extractieprocedures werden waar mogelijk op ijs uitgevoerd om RNA-afbraak te minimaliseren. RNA-concentratie en zuiverheid werden beoordeeld vóór latere experimenten, en alleen monsters met een A260/A280-verhouding tussen 1,8 en 2,0 werden gebruikt voor latere analyses.
Complementair DNA (cDNA) werd gesynthetiseerd met behulp van een reverse transcriptiekit volgens het protocol van de fabrikant. Vervolgens werd kwantitatieve RT-PCR uitgevoerd met behulp van SYBR Green Master Mix op een realtime PCR-detectiesysteem. Elke reactie werd voorbereid in een eindvolume van 10 μL met 5 μL SYBR Green Master Mix, 0,4 μL forward primer, 0,4 μL reverse primer, 1 μL cDNA-template en 3,2 μL nucleasevrij water. Versterking werd uitgevoerd onder de volgende cyclische omstandigheden: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 30 seconden, gevolgd door 40 denaturatiecycli bij 95 °C gedurende 5 seconden en annealing/extensie bij 60 °C gedurende 30 seconden. Elk experiment werd uitgevoerd met drie biologische replicata, en alle reacties werden in drievoud uitgevoerd.
GAPDH werd gebruikt als intern referentiegen, en de relatieve mRNA-expressieniveaus van CYP11A1 en KCNH2 werden berekend met de 2−ΔΔCt-methode . Een enkele piek in smeltcurveanalyse werd beschouwd als indicatief voor specifieke versterking. De primersequenties die voor RT-PCR worden gebruikt, staan vermeld in Aanvullende Tabel 2.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Mendeliaanse randomisatie
De MR-resultaten die de causale effecten tussen drugbare genexpressie en HF evalueren, werden gepresenteerd in Aanvullende Tabel 3. Een door FDR gecorrigeerde P-waarde van minder dan 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. In totaal werden 11 genen met significante causale associaties met HF geïdentificeerd (Figuur 2). Hiervan waren zes genen geassocieerd met een verhoogd risico op HF, w...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit onderzoek evalueerde systematisch de causale effecten van drugbare genen op het HF-risico met behulp van MR, waarbij acht potentiële therapeutische doelwitten werden geïdentificeerd. Deze omvatten vier beschermende factoren (APOM, CHD4, IL11RA en LPAR5) en vier risicofactoren (CYP11A1, GALT, KCNH2 en METRN). Deze associaties werden verder ondersteund door colocalisatieanalyse en SMR. Functionele annotatie via GO, KEGG-verrijking en PPI-netwerkanalyses suggereerden dat deze genen HF v...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.
De deelnemers en onderzoekers van de FinnGen-studie worden erkend. Het eQTLGen-consortium, DGIdb en andere onderzoekers die openbaar beschikbare gegevens voor deze analyse hebben geleverd, worden ook dankbaar erkend. Dit werk werd ondersteund door het Master's Research Innovation Project van het First Clinical College van de Chongqing Medical University (CYYY-SSCX202516) en de gestandaardiseerde diagnose en behandeling van hartfalen (2025cyjstg006).
Bijdrage van de auteur
Huiling Zhu droeg bij aan het concept, het verkrijgen van financiering, het onderzoek, de methodologie, de middelen, software, supervisie, validatie, het schrijven van het oorspronkelijke concept en het beoordelen en redigeren van het manuscript. Suxin Luo droeg bij aan de financiering van de acquisitie, methodologie, supervisie, beoordeling en redigering van het manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2× Universal SYBR Green Fast qPCR Mix | Abclonal | RK21203 | |
| AC16 | HyCyte | TCH-C119 | |
| AC16 cel-specifiek kweekmedium | HyCyte | TCH-G119 | |
| cDNA reverse kit | Abclonal | RK20400 | |
| CFX96™ Real-Time systeem | Bio-Rad Laboratories | ||
| Mitotane | TargetMol | T1199 | |
| Palmitinezuur | TargetMol | T2908 | |
| RNA extractie kit | Abclonal | RK30120 |
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen