Methodenartikel

Gestandaardiseerde workflow voor high-content imaging en gegevensverwerking

DOI:

10.3791/71863

⸱

21 augustus 2026

 ,  , 
1College of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Institute of Interdisciplinary Studies, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Life Science and Technology, Southeast University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor gestandaardiseerde high-content imaging en gegevensverwerking van met propidiumjodide (PI)/Hoechst 33342-gekleurde cellen om reproduceerbare cellevensvatbaarheidsanalyses uit te voeren met behulp van geautomatiseerde workflows voor beeldacquisitie en -analyse.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de uitdagingen van een lage reproduceerbaarheid door operationele variaties in wetenschappelijke beeldvorming en de complexiteit van het analyseren van een groot aantal monsters met conventionele methoden aan te pakken, introduceren wij een protocol voor het kleuren van HT22-cellen met PI en Hoechst 33342, gevolgd door beeldvorming en data-analyse met behulp van het High-Content Imaging System. Deze workflow is erop gericht om robuuste parameters voor de beeldinstellingen en strikte kwaliteitscontrolestandaarden vast te stellen. Het demonstreert de beeldinstellingen van het instrument en de workflow voor drie verschillende beeldverwerkingsmethoden die door het instrument worden aangeboden: Multi-Wavelength Cell Scoring (Multi), Live-Dead (Live) en Custom Module Editor (CME). De beeldverwerkingsmethoden worden vergeleken en gevalideerd aan de hand van de traditionele methode, ImageJ, om hun effectiviteit te waarborgen. De studie vat uiteindelijk een workflow samen voor het gebruik van het High-Content Imaging System om de cellevensvatbaarheid te bepalen met de PI- en Hoechst-dubbelkleuringsmethode. Door de gehele workflow voor beeldvorming en gegevensverwerking te standaardiseren, verbetert de studie aanzienlijk de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van wetenschappelijke beeldvorming, waardoor een solide methodologische basis wordt geboden voor gegevensvergelijking tussen laboratoria en wetenschappelijk onderzoek wordt bevorderd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een High-Content Imaging-systeem dient als een cruciaal instrument in modern wetenschappelijk onderzoek, waarbij snelle beeldvorming en multi-parameterbeoordeling van beschadigde of onbeschadigde cellen mogelijk worden gemaakt1,2,3. Het speelt een onmisbare rol in diverse disciplines. Binnen de levenswetenschappen ondersteunt het onderzoekers bij het verkennen van de microscopische wereld van cellen en weefsels4,5. Zo maakt de nauwkeurige detectie van fluorescentieel gelabelde moleculen en structuren binnen cellen een heldere visualisatie van cellulaire fijnstructuren en dynamische veranderingen mogelijk6. In neurowetenschappelijk onderzoek kan het worden ingezet voor driedimensionale beeldvorming van neuronen, wat bijdraagt aan de analyse van de complexe verbindingen en signaaltransductiemechanismen van neuronale netwerken en cruciale aanwijzingen biedt voor het begrijpen van hersenfuncties en de pathogenese van neurologische ziekten7,8,9.

Ondanks de aanzienlijke voordelen van High-Content Imaging System-technologie blijven er verschillende problemen bestaan in het beeldvormingsproces. In de fase van monstervoorbereiding is er sprake van een hoge mate van subjectiviteit. Bij de voorbereiding van biologische monsters ontbreken relevante standaarden voor processen zoals celbehandeling en kleuring. Wat betreft de beeldvormingsparameters zijn er opvallende verschillen in belichtingstijden en de keuze van wellplates tussen laboratoria en modellen van high-content microscopen. In de fase van gegevensverwerking is er een gebrek aan standaardisatie, variërend van ruisonderdrukking en contrastaanpassing van ruwe beelden tot de parameteridentificatie en bepaling van doeleigenschappen. Deze kwesties leiden direct tot biases in de microscopische beeldvormingsresultaten, wat resulteert in een reproducebaarheidscrisis.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol maakt gebruik van een commerciële cellijn (HT22, ATCC) en is niet betrokken bij menselijke proefpersonen of primaire menselijke weefsels. Er zijn geen dieren gebruikt in deze studie.

1. Gestandaardiseerde monsterpreparatie

  1. HT22-cellen voorbereiden
    1. Wanneer de confluentie van de HT22-cellen 80% bereikt10,11, verwijder dan het oude medium. Gebruik 0,25% trypsine om de cellen los te maken door 1–2 min bij kamertemperatuur te incuberen.
    2. Voeg Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) toe in een volume van 3x dat van de 0,25% trypsine om het losmaken te stoppen. Overbreng de celsuspensie naar een centrifugebuis van 15 mL.
    3. Centrifugeer gedurende 3 min bij 175 x g bij kamertemperatuur en verwijder vervolgens het supernatant. Resuspendeer de cellen in compleet DMEM om een single-cell suspensie te maken.
    4. Tel de cellen met behulp van een telkamer. Zaai 5.000 cellen per putje in 100 µL compleet medium uit in een 96-wellplaat12.
    5. Incubeer de plaat 24 h bij 37 °C met 5% CO2. Voer de monstergroepering, dosering en kleuringsstappen in de 96-wellplaat uit volgens het experimentele ontwerp.
      ​OPMERKING: Gebruik een 96-wellplaat die compatibel is met het imagesysteem. Kies een plaat met de juiste bodemdikte en geometrie, conform de specificaties van de fabrikant. Platen met een glazen bodem (bodemdikte 130–170 µm) worden aanbevolen wanneer een hogere beeldkwaliteit vereist is13,14,15,16.
  2. Kleuringsprocedure
    1. Zorg ervoor dat de cellen een enkele, goed verspreide monolaag vormen en dat de confluentie niet meer dan 70% bedraagt om celoverlap te minimaliseren (Figuur 1B).
    2. Groepeer de monsters volgens de experimentele vereisten en ga na de behandeling over tot de kleuring. Bereid de werkoplossingen van de kleurstof voor met een eindconcentratie van 6,684 µg/mL voor PI en 10 µg/mL voor Hoechst 3334217,18.
    3. Verwijder het oude medium uit de 96-wellplaat en was elk putje twee keer met 100 µL PBS. Voeg de werkoplossing van de kleurstof toe en incubeer 30 min bij kamertemperatuur in het donker voor de kleuring.
    4. Was elk putje twee keer met 100 µL PBS en voeg vervolgens DMEM toe.
      OPMERKING: Verschillende experimentele ontwerpen kunnen variaties bevatten in de parameters voor monsterbelading en kleuring.

2. Beeldingsspecificaties en parameterinstellingen

  1. Standaarden voor beeldvormingsparameters
    ​OPMERKING: Deze studie demonstreert uitsluitend de widefield-beeldvormingsworkflow voor het instrument na kleuring met PI en Hoechst 33342.
    1. Zet het instrument aan en start vervolgens de computer op. Open de analyse-software die bij het apparaat is geleverd.
    2. Plaats de 96-wellplaat in het instrument. Selecteer het gezichtsveld met de monsters voor beeldvorming.
    3. Stel in de Objective and Camera-instellingen de Magnification in op "20XPh1SPlanFluorELWDADM" (Nikon, S Plan Fluor, ELWD, 20X/0.45, ∞/0-2, WD 8.2-6.9, OFN22, Ph1, AMD, MRH48230), de Camera binning op "2" en de Acquisition Mode op "Widefield".
    4. Selecteer in de plaatmodus de overeenkomstige parameters van de 96-wellplaat en pas de plaatparameters aan op basis van de productafmetingen.
    5. Selecteer onder Site Option doorgaans 9 velden per well voor intensieve beeldvorming. Selecteer in de Autofocus-opties Enable laser-based focusing.
    6. Pas de laser-autofocusparameters onder Autofocus aan, gebaseerd op de gemiddelde dikte van de plaatbodem gemeten bij ten minste drie monsterwells. Pas de Bottom thickness, Bottom thickness max variation, Adjacent well max variation, Intra-well max variation en Plate max variation dienovereenkomstig aan.
    7. Stel onder Wavelengths het Number of wavelengths in op 3. Selecteer voor de eerste Illumination DAPI. Kies bij Shading Correction voor "Auto Correction for FL" (Afbeelding 2B).
    8. Zodra het beeld is gevonden, wordt de initiële Exposure (ms) ingesteld op 20–30. Observeer de vastgelegde beelden en pas de belichting continu aan om een matige fluorescentie-intensiteit zonder overbelichting te bereiken, en stel de bit-diepte in op 16 (Afbeelding 2A).
    9. Kies Laser with z-offset voor de focusaanpassing. Als de focus niet scherp is, vink dan Use Z stack aan, klik op Calculate Offset en selecteer een geschikte brandpuntsafstand. Vink Digital Confocal (info) aan en stel de aanpassingsparameters voor Increase Sharpness en Reduce Noise in op 0,200.
      OPMERKING: Als de belichting of helderheid van het beeld niet bevredigend is, pas dan de belichting aan en bereken de offset-parameters opnieuw.
    10. Selecteer voor de tweede Illumination Cy3. Volg dezelfde instellingen als in stappen 2.1.7-2.1.9.
    11. Selecteer voor de derde Illumination TL 25. Volg dezelfde instellingen als in stappen 2.1.7-2.1.9.
      OPMERKING: Stel de Shading correction in op basis van het kanaal; voor TL 25 moet Auto Correction for TL worden gekozen. In Wavelengths moet het TL-kanaal worden ingesteld voor celpositionering en morfologische observatie.
    12. Geef in het tabblad Run de plaat een naam volgens de naamgevingconventie: plaatnaam-celtype-experiment-ID-datum-objectiefvergroting-beeldvormingstype. Bevestig de parameters met betrekking tot het beeldvormingskanaal onder Description.
    13. Klik op Acquire Plate om te beginnen met de beeldvorming. Schakel na voltooiing van de beeldvorming de software, het instrument en de computer in opeenvolgende volgorde uit.
      ​OPMERKING: Vervolgens mag de computer alleen worden geopend voor export van beelden, gegevensverwerking en resultaatanalyse
  2. Standaarden en vereisten voor de beeldvormingsoperatie
    1. Centreer het gezichtsveld op de well om randeffecten te voorkomen (Afbeelding 1A). Gebruik tijdens het instellen van de beeldvormingsparameters de positieve controle met de hoogste fluorescentie-intensiteit als referentie. Kies bij het focussen bovendien een gezichtsveld met een enkele laag cellen, schoon en vrij van debris.
    2. Houd voor de camera de pixelwaarden strikt onder 60000 (de maximale waarde is 65535) om verzadiging te voorkomen, wat kan leiden tot permanent verlies van informatie. Als verzadigde heldere vlekken of gebieden verschijnen, verkort dan de belichting. Houd tegelijkertijd de belichtingstijd niet te laag; anders zal ruis het beeld domineren.
    3. Geef bij zwakke fluorescentiesignalen prioriteit aan een lichte verhoging van de belichting in plaats van het forceren van de parameters, om onomkeerbare schade door fotobleking te voorkomen.
      OPMERKING: Voor bright-field-beeldvorming kunnen deze principes适当 worden versoepeld, maar de kern blijft gericht op signaalintegriteit en monsterbescherming.
    4. Zorg ervoor dat de randcontouren van het monster duidelijk onderscheidbaar zijn en dat de interne fijne structuren (zoals korrels, vezels, organellen) duidelijke texturen hebben, niet vervaagd zijn en dat het gestrooide achtergrondlicht gelijkmatig is verdeeld zonder lokale heldere vlekken of vervaagde halo's. Vermijd strikt over-focussering en onder-focussering.
    5. Zorg ervoor dat er normale, positieve, negatieve en experimentele groepen zijn, en dat elke behandelgroep ten minste 3 parallelle wells heeft. Het wordt aanbevolen om de parallelle wells verticaal te plaatsen.

3. Beeldbewerking en analyse

OPMERKING: Dit document beschrijft drie beeldverwerkingsmethoden die worden aangeboden door de begeleidende software van het instrument, waarvan alle drie geschikt zijn voor het in deze studie gebruikte kleuringsprotocol. Hoewel deze methoden hetzelfde onderliggende principe van herkenning delen, verschillen ze in specifieke verwerkingstechnieken en typen dataresultaten. De workflow voor de beeldverwerking was als volgt: Open het bestand → Laad de originele afbeelding met de bijbehorende verwerkingsmethode → Stel de juiste kanaalparameters in → Genereer een masker → Stel het meetdatatype in bij 'Measure' → Voer de analyse uit → Observeer de resultaten → Exporteer de gegevens.

  1. Open de analyse-software die bij het apparaat is geleverd → Review Plate → Select Plate.
  2. Selecteer in de weergave Date de optie Well arrangement en kies een gezichtsveld uit de positieve groep als referentie.
  3. Selecteer onder Run Analysis het overeenkomstige verwerkingsprogramma en stel de parameters voor beeldverwerking in of exporteer de afbeelding.
  4. Selecteer na het instellen en opslaan van de parameters de optie Run on all wells/ Run on selections/ Run on displayed site, afhankelijk van het object voor de parameterinstelling.
  5. Nadat de computer de gegevensverwerking heeft voltooid, selecteert u onder het tabblad Measurements het overeenkomstige gegevensverwerkingsprogramma onder Analysis en kiest u in Measurement verschillende meetresultaten om de gegevens te controleren.
  6. Klik op Open Log om de gegevens te exporteren. Stel de volgende details in de parameterinstellingen in voor de drie beeldverwerkingsmethoden:
    1. Beeldverwerkingsmethode één: Multi-Wavelength Cell Scoring
      1. Selecteer het programma Multi-Wavelength Cell Scoring en configureer de instellingen. Stel het aantal golflengten (Number of wavelengths) in. Kies Standard voor het algoritme (Algorithm).
      2. Stel de herkenningsparameters voor alle kernen in op basis van de PI-kleuringsresultaten. De standaard W1 Source-afbeelding is het DAPI-kanaal.
      3. Stel de Approximate min width in op 8–10 µm en de Approximate max width op 30–35 µm, gebaseerd op de grootte van de individuele objecten die herkend moeten worden.
      4. Stel de intensity above local background in op 2.000–10.000 grijswaarden. Gebruik Preview om de instellingen te testen en aan te passen op basis van de herkenningsresultaten.
      5. Stel de W2-parameters in op basis van de Hoechst 33342-kleuringsresultaten. Geef dit kanaal een naam. De W2 Source-afbeelding is Cy3.
      6. Selecteer in Stained area de regio die door dit kanaal is gekleurd als Nucleus. Volg voor verdere instellingen dezelfde stappen als in 3.6.1.3–3.6.1.4. Selecteer in Configure Summary Log of Configure Data Log (Cells) de overeenkomstige Parameter configuration op basis van de gewenste resultaatparameters.
        OPMERKING: Normaal gesproken wordt Configure Summary Log gebruikt om de vereiste gegevenstypen in te stellen, terwijl Configure Data Log (Cells) wordt gebruikt wanneer speciale markering van individuele cellen nodig is.
      7. Voer een Test Run uit om de herkenning te observeren. Sla de instellingen op als u tevreden bent met de herkenningsresultaten.
    2. Beeldverwerkingsmethode twee: Live-Dead
      1. Selecteer het Live-Dead-programma en begin met het configureren van de instellingen. Stel achtereenvolgens de Wavelength 1 Parameters en Wavelength 2 Parameters in.
      2. Stel onder Wavelength 1 Parameters de Wavelength 1 Source in op DAPI. Het standaard algoritme is "Standard".
      3. Stel op basis van de kleuringscondities Stained cell type in op All Cells en Stained area op Nucleus. Stel Approximate min width, Approximate max width en intensity above local background in met dezelfde instellingen als bij de Multi-Wavelength Cell Scoring-methode.
      4. Vink Split touching objects aan en gebruik Preview om te testen.
      5. Stel onder Wavelength 2 Parameters de Wavelength 2 Source in op Cy3.
      6. Stel op basis van de specifieke kleuring Stained cell type in op Dead en Stained area op Nucleus. Stel Approximate min width, Approximate max width en intensity above local background in met dezelfde instellingen als bij de Multi-Wavelength Cell Scoring-methode.
      7. Klik op Configure Summary Log en selecteer de Parameter configuration op basis van de vereiste gegevenstypen. Voer een Test Run uit om de herkenning te observeren. Sla de instellingen op als u tevreden bent met de herkenningsresultaten.
    3. Beeldverwerkingsmethode drie: ontwikkelaarsmodus CME
      1. Selecteer het Custom Module (CME)-programma en begin met het configureren van de instellingen. Stel Image Names en kanalen in.
        OPMERKING: Om latere parameterinstellingen te vergemakkelijken, stelt u deze over het algemeen in op de kanaalnamen die tijdens de beeldvorming zijn gebruikt.
      2. Open in Find Objects de optie Simple Threshold om de herkenning voor de gehele set in te stellen.
      3. Stel Source zo in dat deze overeenkomt met Image Name. Vul op basis van het 16-bit grijswaardenbereik 0 in bij Threshold Low en 65535 bij Threshold High.
      4. Geef het verwerkingsresultaat een naam in Result, pas dit toe en observeer de markering. Open in Find Objects de optie Find Blobs om een Mask-resultaat te genereren.
      5. Stel Source zo in dat deze overeenkomt met Image Name, net als bij Simple Threshold. Stel Approximate min width, Approximate max width en intensity above local background in volgens de Multi-Wavelength Cell Scoring-instellingen.
      6. Geef het verwerkingsresultaat een naam in Result, pas dit toe en observeer het markeringsresultaat. Gebruik voor het Find Blobs-herkenningsresultaat de tool Modify Objects om te filteren, uit te breiden (grow), te verkleinen (shrink) en te inverteren.
      7. Stel onder Measure de optie Modified in. Voer bij Measurement Inputs de waarde 1 in voor Standard Area Value en vink Create Object Overlay aan.
      8. Selecteer in Objects to Measure de bron van de gemarkeerde objecten in Mask of Objects en de te meten bronafbeelding in Image to Measure. Kies de overeenkomstige Measurement Name op basis van de vereiste verwerkingsresultaatparameters, pas dit toe en observeer het parameterherkenningsresultaat.
      9. Sla de configuratie op na het bevestigen van de parameterinstellingen.
    4. Algemene methode: ImageJ
      ​OPMERKING: Analyseer de beeldresultaten met de ImageJ-methode voor fluorescentiebeelden19 en voer vervolgens een vergelijkende analyse uit met de drie methoden van dit instrument.
      1. Open de ImageJ-software. Beelden importeren: File → Open → Selecteer de originele grijswaardenafbeelding die geanalyseerd moet worden.
      2. Converteer de afbeelding naar 8-bit: Image → Type → 8-bit. Herkenning van grijswaarden: Image → Adjust → Threshold → Default, Red → Vink Dark background aan → Set → OK.
        OPMERKING: Als de herkenning van het rode gebied onvoldoende is, vervang Default dan door een van de andere 16 ingebouwde ImageJ-herkenningsmodellen of pas de schuifregelaar in het dialoogvenster aan.
      3. Parameters instellen: Analyze → Set Measurements. Vink in het pop-updialoogvenster Area, Mean gray value, Integrated density, Limit to threshold, Display label aan, zet Redirect standaard op None en voer 2 in voor Decimal places (0-9). Klik op OK.
      4. Herkenningsresultaten analyseren: Analyze → Measure. Resultaten opslaan: In het pop-updialoogvenster voor resultaten: File → Save As, en selecteer de opslaglocatie.
  7. Beeldexport
    1. Selecteer een hoogwaardig gezichtsveld van een positieve well als referentiestandaard.
      OPMERKING: De basiskwaliteitseisen zijn authenticiteit, nauwkeurige focus, geschikte belichting (16-bit) en passend contrast (een hogere signaal-ruisverhouding is beter). Hoogwaardige eisen omvatten duidelijke kenmerken, contrast, bruikbaarheid, intuïtieve morfologische veranderingen en geaccentueerde kernpunten.
    2. Selecteer onder Run Analysis de optie ExportPro in de sectie Analysis en start Run Setup for Analysis. Kies bij Select output options voor Individual channel, Color overlay, shrink image (optioneel) en Scale bar (optioneel) op basis van de beeldvereisten.
    3. Selecteer de fluorescentiekanaalbeelden die voor elk gezichtsveld geëxporteerd moeten worden. Selecteer bij Individual Channel een kleur voor elk kanaal, zoals Blue voor het DAPI-kanaal en Monochrome voor het TL-kanaal.
    4. Selecteer bij Color overlay achtereenvolgens de kanalen die overeenkomen met BRIGHTFIELD, RED, BLUE en GREEN (selecteer de kleurgolflengte voor color overlay). Stel het Number in op 100; observeer het voorbeeldbeeld en accepteer het preview-resultaat.
    5. Selecteer bij output de map waarin de geëxporteerde beelden worden opgeslagen bij Export to folder. Start de run.
      OPMERKING: Beelden uit dezelfde batch mogen niet afzonderlijk worden geëxporteerd; een batch beelden verwijst naar een verzameling beelden van vier kernmonsters: negatieve controle, positieve controle, basiscontrolegroep en doel-experimentele groep, allemaal verkregen onder volledig consistente experimentele omstandigheden.
  8. Vergelijking van beeldverwerkingsmethoden
    1. Selecteer 9 gezichtsvelden en vergelijk het traditionele handmatige tellen van dode en levende cellen met de methoden Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME en ImageJ voor het tellen van levende cellen, dode cellen en de verhouding tussen dode en levende cellen. Gebruik GraphPad Prism versie 10.1 om een één-weg ANOVA uit te voeren, vergezeld van de Tukey-toets voor meervoudige vergelijkingen, om de verschillen te analyseren.
    2. Selecteer 81 gezichtsvelden en vergelijk de verschillen in cel telling, oppervlakte en intensiteit tussen de methoden Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME en ImageJ. Gebruik GraphPad Prism versie 10.1 om een één-weg ANOVA uit te voeren, vergezeld van de Tukey-toets voor meervoudige vergelijkingen, om de verschillen te analyseren.
      OPMERKING: Celkweek- en kleuringsexperimenten moeten in een veiligheidskast voor biologische agentia worden uitgevoerd. Voer afvalvloeistof, tips en ander experimenteel afval af volgens de laboratoriumregels. Zorg voor volledige bescherming tijdens het gehele experiment.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Impact van gestandaardiseerde preparatie op de beeldkwaliteit

De plaatparameters werden geconfigureerd om ervoor te zorgen dat het instrument de celafbeeldingslaag betrouwbaar kon lokaliseren. Monsters die waren voorbereid als een enkele laag cellen met een matige confluentie vergemakkelijkten de beeldfocussering bij verschillende objectiefvergrotingen en verbeterden de beeldherkenning en kwantitatieve analyse. Gestandaardiseerde monstervoorbereiding en geoptimaliseerde plaatparameters minimaliseerden effectief randeffecten, celoverlap en andere factoren die bijdroegen aan beeldvorming van slechte kwaliteit (Figuur 1).

Vergelijking van de functies van de beeldberekeningsmethode

De dubbele kleuringsmethode met PI/Hoechst 33342 werd gebruikt om levende en dode cellen te onderscheiden. De methoden Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead en CME verwerkten deze beelden succesvol door objecten te identificeren op basis van fluorescentie-intensiteit en objectgrootte, terwijl ImageJ objecten identificeerde op basis van grijswaarden. De markeringsresultaten verkregen met deze methoden waren over het algemeen vergelijkbaar (Figuur 3A–E).

De methode voor celscoring met meerdere golflengten vereist kernkleuring om alle cellen te identificeren (Figuur 4A). Het kan tot 7 beeldkanalen verwerken en parameters berekenen, waaronder celgetal, oppervlakte en optische dichtheid.

De Live-Dead-methode was flexibeler dan de Multi-Wavelength Cell Scoring-methode. Beide kanalen bieden modules voor kernkleuring, cytoplasmatische kleuring of gecombineerde kern-cytoplasmatische kleuring om alle cellen, levende cellen of dode cellen te identificeren. De Split touching objects-functie scheidt overlappende objecten, waardoor de berekening van het celgetal, het oppervlak en de optische dichtheid mogelijk is. Omdat deze echter alleen data uit twee kanalen verwerkte, was de methode bijzonder geschikt voor PI/Hoechst 33342 dubbelgekleurde celviabiliteitsassays (Figuur 4B).

De CME-methode was afhankelijk van door de gebruiker gedefinieerde logica voor beeldverwerking. Het aantal verwerkte kanalen kwam overeen met het aantal verworven kanalen. De herkenningsresultaten werden verfijnd met behulp van functies zoals Fill Holes, Invert Objects, Grow Objects, Shrink Objects, Logical Operations, Remove Border Objects, Keep Marked Objects, Grow Objects without Touching, Mark Object Centers, Watershed, Remove Marked Objects en Filter Mask om onzuiverheden en andere storingsbronnen te elimineren. Deze methode maakte het daarnaast mogelijk om meerdere objectparameters te berekenen voor multidimensionale analyse.

ImageJ kon geen meerdere kanalen gelijktijdig verwerken. Voor seriebeelden met aanzienlijke variaties in de achtergrond waren handmatige verwerking en drempelwaarde-aanpassingen nodig, wat de subjectiviteit verhoogde en de reproduceerbaarheid verminderde.

Analyse van verschillen in verwerkingsresultaten

Een vergelijkende analyse van de beeldverwerkingsmethoden toonde geen significante verschillen in het totale aantal cellen, het aantal dode cellen of de ratio van dode cellen ten opzichte van alle cellen tussen de Multi-Wavelength Cell Scoring-, Live-Dead-, CME-, ImageJ- en traditionele handmatige telmethoden over 9 gezichtsvelden (Figuur 5A–C, Aanvullend Bestand 1).

Op vergelijkbare wijze werd er geen significant verschil waargenomen in de verhouding tussen het oppervlak van dode cellen en het totale celoppervlak tussen de methoden Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME en ImageJ. Er werd echter wel een significant verschil waargenomen in de verhouding tussen de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van dode cellen en die van alle cellen tussen de methoden Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead en CME, op basis van gegevens verkregen uit 81 gezichtsvelden (Figuur 5D–F).

Op basis van deze bevindingen is een gestandaardiseerde workflow voor het High-Content Imaging System vastgesteld (Figuur 6).

figure-results-1
Figuur 1: Beeldresultaten van lage kwaliteit. (A) Het gezichtsveld bevindt zich dicht bij de rand van de put, waardoor schaduwen van de putrand zichtbaar zijn (in dit geval BV2-cellen). (B) Pijlen a en b geven de overlap van cellen in het DAPI-kanaal en het TL-kanaal aan, met overmatige celconfluentie, en zelfs een tweede laag of enkele zwevende cellen. (C) Het gezichtsveld bevat geen cellen; de plaatparameters zijn onjuist; de focus ligt niet op de cellaag, of de cellen zijn niet gekleurd, wat resulteert in geen beeld in dit gezichtsveld. Schaalbalk = 100 µm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Instellingen van de beeldvormingsparameters. (A) Pijl a geeft het icoon voor de bitdiepte aan. (B) Pijl b geeft de positie van de Shading Correction aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Resultaten van hetzelfde gezichtsveld geïdentificeerd via verschillende methoden. (A) Resultaten van het Multi-Wavelength Cell Scoring-masker: de grijze en rode gebieden vertegenwoordigen alle celkernen geïdentificeerd in het DAPI-kanaal, waarbij het rode gebied de kernen van dode cellen vertegenwoordigt die zijn geïdentificeerd in het Cy3-kanaal. (B) Resultaten van het Live-Dead-masker: de groene en rode gebieden vertegenwoordigen alle celkernen geïdentificeerd in het DAPI-kanaal, waarbij het rode gebied overeenkomt met de kernen van dode cellen geïdentificeerd in het Cy3-kanaal. (C) Resultaat van het CME-masker: de gele en blauwe gebieden vertegenwoordigen alle celkernen geïdentificeerd in het DAPI-kanaal, waarbij het blauwe gebied overeenkomt met de kernen van dode cellen geïdentificeerd in het Cy3-kanaal. (D) ImageJ-masker resultaat in DAPI. (E) ImageJ-masker resultaat in Cy3. Schaalbalk = 100 µm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Pagina's met gedeeltelijke parameterinstellingen. (A) De door a aangegeven locatie laat zien dat het eerste kanaal van Multi-Wavelength Cell Scoring alleen de kern kan selecteren; (B) b en c geven aan dat Live-Dead slechts twee kanalen kan verwerken, waarbij PI/Hoechst 33342 dubbelkleuring voor dode en levende cellen wordt ondersteund. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Verschillen in de resultaten van de fluorescentiebeeldverwerking. (A) Verschillen in het totale aantal cellen tussen de vijf verwerkingsmethoden. (B) Verschillen in het aantal dode cellen tussen de vijf verwerkingsmethoden. (C) Verschillen in de ratio van dode cellen ten opzichte van alle cellen tussen de vijf verwerkingsmethoden. (D) Verschillen in de ratio van dode cellen ten opzichte van alle cellen tussen de vier verwerkingsmethoden. (E) Verschillen in de ratio van het oppervlak van dode cellen ten opzichte van het totale celoppervlak tussen de vier verwerkingsmethoden. (F) Verschillen in de ratio van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van dode cellen ten opzichte van die van alle cellen over de vier verwerkingsmethoden. Alle foutenbalken in de grafieken vertegenwoordigen standaarddeviaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Gestandaardiseerd operationeel proces. Workflow die de gestandaardiseerde procedure voor monstervoorbereiding, fluorescentiekleuring, high-content imaging, beeldbewerking, beeldexport en data-analyse samenvat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1. Ruwe gegevens voor de analyse van celaantal, oppervlakte en fluorescentie-intensiteit weergegeven in Figuur 5. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij het gebruik van de PI- en Hoechst-dubbelkleuringsmethode om de celviabiliteit te bepalen, kan een high-content instrument bijvoorbeeld snel en op een high-throughput manier de celviabiliteit binnen dezelfde batch berekenen met behulp van ingebouwde algoritme-modules. Deze methode biedt verschillende voordelen, waaronder een laag samplevolume, lage kosten, minimale celbeschadiging, gering fluorescentie-bleken, resistentie tegen quenching en de mogelijkheid om meerdere beelden vast te leggen. Bovendien is de beeldvormingstijd voor een 96-wells plaat over het algemeen slechts 30–45 min20.

Richt u in het experimentele protocol, om de beeldkwaliteit te waarborgen, op de volgende stappen: Zorg eerst voor een geschikte platedichtheid om een te hoge celdichtheid te voorkomen, waardoor het beeld volledig door cellen kan worden gevuld, of een onvoldoende dichtheid, waardoor cellen tijdens het kleuren en wassen kunnen wegspoelen. Ten tweede moet de kleurstof grondig worden uitgewassen om te voorkomen dat residuen de beeldvorming beïnvloeden. Behandel bij cellen met een lage adhesie het toevoegen en verwijderen van vloeistof voorzichtig en langzaam vóór en na het kleuren, en vermijd verticale toevoeging. Voeg vloeistoffen via de zijwand toe om te voorkomen dat cellen in het centrum van het gezichtsveld verloren gaan, waarbij speciale aandacht moet uitgaan naar het loslaten van dode cellen tijdens levensvatbaarheidstesten. Overweeg indien nodig om de monsterplaat te centrifugeren om experimentele fouten te verminderen. Ten derde moet een geschikte belichtingstijd worden gekozen. Een te lange belichting verhoogt de totale beeldvormingstijd en kan leiden tot het missen van het detectievenster, wat potentieel kan resulteren in overbelichting van sommige cellen of het registreren van de achtergrond. Een te korte belichting kan leiden tot onvolledige beeldinformatie, waardoor sommige kenmerkende details verloren gaan.

Als er tijdens de beeldvorming geen duidelijk beeld kan worden gevonden, moet de oorzaak worden herleid naar de conditie van de cellen, kleurstofresiduen, parameterinstellingen en andere factoren. Wanneer er tijdens het experiment geen cellen op de bodem van de put aanwezig zijn, zal er geen beeld in het gezichtsveld worden gevonden. Als er twee of meer ongelijkmatige cellagen op de bodem van de put ontstaan, wordt scherpstellen moeilijk, wat resulteert in een wazig beeld. Overmatige kleurstofresiduen kunnen leiden tot een sterke achtergrond, waardoor het doelbeeld minder prominent wordt. Grote gebieden met kleurstofresiduen kunnen cellen in het gezichtsveld maskeren, terwijl kleine residu-deeltjes, die qua grootte vergelijkbaar zijn met cellen, de daaropvolgende beeldherkenning en segmentatie kunnen storen. Als de plaathoogte en puthoogte niet zijn ingesteld volgens de specificaties van de fabrikant voor de 96-wells plaat, zal er geen beeld in het gezichtsveld worden gevonden, of kan de monsterpositie verschuiven, wat mogelijk schade aan de objectieflens veroorzaakt.

Gezien de flexibiliteit en eenvoud van gebruik, evenals de goede resultaten bij de gegevensverwerking, is Live-Dead de optimale beeldbewerkingsmodule voor de dubbele kleuringsmethode met PI en Hoechst. Dit programma is specifiek geoptimaliseerd voor PI- en Hoechst-kleurstoffen en is, in vergelijking met andere methoden en software, eenvoudig in gebruik, berekent snel en maakt het eenvoudig mogelijk om afbeeldingen in batches in de database te laden met consistente parameterinstellingen. De resultaten zijn beter vergelijkbaar dan die verkregen met de momenteel gangbare software, ImageJ. Voor verschillende experimentele modi kunnen de overeenkomstige eigen methoden of de algemene berekeningsmodus Multi-Wavelength Cell Scoring worden gebruikt; eigen methoden zijn praktischer, terwijl de algemene berekeningsmodus minder beperkingen stelt aan de kleuringsmethoden. Verschillende kleuringsprotocollen vereisen verschillende optimale beeldbewerkingsmodules. Ontwikkel computationele methoden die zijn afgestemd op de experimentele doelstellingen. De ExportPro-methode voor beeldexport is eenvoudig en gemakkelijk te leren, waardoor referentieobjecten vooraf kunnen worden bekeken. Het is gebruiksvriendelijk voor beginners, met een grafische interface die de betekenis van parameters duidelijk uitlegt en metingen vereenvoudigt, wat de drempels voor analyse met meerdere softwarepakketten verlaagt en tijd bespaart bij het aanleren van de tools.

Deze studie heeft enkel een basisprotocol voor kleuring gevalideerd. Ter referentie moeten andere experimentele protocollen die significant afwijken van dit protocol nog steeds worden gevalideerd ten opzichte van de nieuwe standaard.

Een High-Content Imaging System dient als een kerntechnologieplatform dat resolutie-imaging, synchrone detectie van meerdere parameters, geautomatiseerde kwantitatieve analyse en high-throughput screening integreert21,22,23. De geïntegreerde opzet van de beeldvormings- en rekenmogelijkheden van het apparaat moet de ontwikkeling en vestiging van overeenkomstige experimentele protocollen en computationele modellen voor meer bestaande imaging-experimenten mogelijk maken7,24, om uiteindelijk de consistentie en vergelijkbaarheid van gegevens te verbeteren die door verschillende operators, op verschillende tijdstippen en over verschillende batches zijn verkregen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling. Tijdens de vertaling van het manuscript is Zhipu AI uitsluitend gebruikt voor vertalingsdoeleinden en niet voor het genereren van onderzoeksgegevens, experimentele resultaten of kerninhoud van de academische tekst. De auteurs dragen de volledige verantwoordelijkheid voor de inhoud van het manuscript.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs danken voor de ondersteuning vanuit het School Foundation van de Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. De auteurs danken voor de ondersteuning vanuit de beurs MPRC2022034. Deze financiering is gebruikt voor de ontwikkeling van een 3D-dynamische beeldgevingsmethode voor darmbacteriën in Erchen Decoction bij de behandeling van simpel obese muizen. De auteurs erkennen het onderzoekplatform dat is gefaciliteerd door het Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy en het Institute of Interdisciplinary Studies.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,5 mL centrifugebuisLabigic Technology Co., Ltd.MCT-001-150
1000 µL pipetpuntenLabigic Technology Co., Ltd.35423003E
15 mL centrifugebuisLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-15A
2,5 µL pipetpuntenQingdao Haier Biomedical Co., Ltd.B10T
200 µL pipetpuntenLabigic Technology Co., Ltd.T-001-200
50 mL centrifugebuisLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-50A
Celkweekplaat met 96 putjesCorning Incorporated3599
Instelbare enkelkanaals pipet, 0,1–2,5 μLEppendorf SE3120000216
Instelbare enkelkanaals pipet, 100–1000 μLEppendorf SE3120000267
Instelbare enkelkanaals pipet, 20–200 μLEppendorf SE3120000259
Instelbare enkelkanaals pipet, 2–20 μLEppendorf SE3120000232
CelkweekschaalCorning Incorporated430167
CryovialsLabigic Technology Co., Ltd.BS-20-ST
Dimethylsulfoxide (DMSO)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.D8371
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Life Technologies Limited11966-025In deze studie werd het complete DMEM bereid met 10% FBS, 1% penicilline-streptomycine-oplossing en 89% DMEM.
ESCO CelCulture CO2 incubatorEsco Micro Pte. Ltd.CCL-170B-8
Foetaal runderserum (FBS, Superfine)Procell Life Science & Technology Co.,Ltd.164210-50
Hoechst 33342 fluorescente kleurstoffenBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.B8040
HT22-celProcell Life Science & Technology Co.,Ltd.CL-0697
ImageJNational Institutes of HealthImageJ is een van de gebruikte softwareprogramma's voor beeldverwerking in het manuscript.
ImageXpress Micro confocale high-content imaging-systemenMolecular Devices, LLCImageXpress Micro ConfocalGebruik in het manuscript "High-Content Imaging System" als vervanging voor de instrumentnaam.
Laagsnelheids vriescentrifugeHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.L530R
MetaXpress High-Content software voor beeldacquisitie en analyseMolecular Devices, LLCDe software is een bijbehorend onderdeel van het ImageXpress® Micro confocal high-content imaging-systeem. In het manuscript verwijst "De bij het apparaat geleverde analysesoftware" naar deze software.
OptiMair verticale laminaire flow-kastEsco Micro Pte. Ltd.ACB-4E1
Parafilm MPechiney Plastic Packaging Inc.PM996
PBS Shanghai Yuchun biology science and technology co., ltd YC-5013
Penicilline-streptomycine-oplossingProcell Life Science & Technology Co.,Ltd.PB180120
Propidiumjodide-oplossing (PI)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.C0080
Trypsine-EDTA-oplossingBasalMedia Technology Co.,Ltd.S310KJ

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dariolli R, Nir R, Mushlam T, Souza GR, Farmer SR, Batista ML. Optimized scaffold-free human 3D adipose tissue organoid culture for obesity and disease modeling. SLAS Discovery. 2025;31:100218.
  2. Menduti G, Boido M. Recent advances in high-content imaging and analysis in iPSC-based modelling of neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 2023;24(19).
  3. Park JC, Mook-Jung I. Toward brain organoid-based precision medicine in neurodegenerative diseases. Organoid. 2022;2.
  4. Geyer M, Schreyer D, Gaul LM, Pfeffer S, Pilarsky C, Queiroz K. A microfluidic-based PDAC organoid system reveals the impact of hypoxia in response to treatment. Cell Death Discovery. 2023;9:20.
  5. Huang CJ, Shieh PC, Yang JS, et al. Pterostilbene suppressed cell viability, induced apoptosis and autophagy of cisplatin-resistant gastric cancer cells. Anticancer Res. 2025;45(2):511-523.
  6. Wang G, Li Y, Sun T, et al. BMSC affinity peptide-functionalized β-tricalcium phosphate scaffolds promoting repair of osteonecrosis of the femoral head. J Orthop Surg Res. 2019;14(1):204.
  7. Uzoechi SC, Collins BE, Badeaux CJ, et al. Effects of amyloid beta (aβ) oligomers on blood–brain barrier using a 3D microfluidic vasculature-on-a-chip model. Appl Sci. 2024;14(9). doi:10.3390/app14093917
  8. Pereira JD, DuBreuil DM, Devlin AC, et al. Human sensorimotor organoids derived from healthy and amyotrophic lateral sclerosis stem cells form neuromuscular junctions. Nat Commun. 2021;12(1):4744.
  9. Cromwell EF, Leung M, Hammer M, Thai A, Rajendra R, Sirenko O. Disease modeling with 3D cell-based assays using a novel flowchip system and high-content imaging. SLAS Technol. 2021;26(3):237-248.
  10. Tabęcka-Łonczyńska A, Skóra B, Szlachcikowska D, et al. Impact of Hericium erinaceus and Ganoderma lucidum metabolites on AhR activation in neuronal HT-22 cells. Pharmacol Rep. 2025;77(6):1557-1572.
  11. Tang J, Chen R, Wang L, et al. Melatonin attenuates thrombin-induced inflammation in BV2 cells and then protects HT22 cells from apoptosis. Inflammation. 2020;43(5):1959-1970.
  12. Zhang W, Sun H, Zhao W, Li J, Meng H. Suppression of JNK pathway protects neurons from oxidative injury via attenuating parthanatos in glutamate-treated HT22 neurons. Sci Rep. 2024;14(1):25793.
  13. Thoudam T, Chanda D, Lee JY, et al. Enhanced Ca2+-channeling complex formation at the ER-mitochondria interface underlies the pathogenesis of alcohol-associated liver disease. Nat Commun. 2023;14(1):1703.
  14. Huang Z, Zhang Q, Wang Y, et al. Inhibition of caspase-3-mediated GSDME-derived pyroptosis aids in noncancerous tissue protection of squamous cell carcinoma patients during cisplatin-based chemotherapy. Am J Cancer Res. 2020;10(12):4287-4307.
  15. Andreyev AY, Yang H, Doulias PT, et al. Metabolic bypass rescues aberrant S-nitrosylation-induced TCA cycle inhibition and synapse loss in Alzheimer’s disease human neurons. Adv Sci. 2024;11(12):2306469.
  16. Backström A, Kugel L, Gnann C, et al. A sample preparation protocol for high throughput immunofluorescence of suspension cells on an adherent surface. J Histochem Cytochem. 2020;68(7):473-489.
  17. Hongxing Tang et al. Protective effects of hinokitiol on neuronal ferroptosis by activating the Keap1/Nrf2/HO-1 pathway in traumatic brain injury. J Neurotrauma. 2024;41(5-6):734-750.
  18. Teerawonganan P, Hasriadi, Dasuni Wasana PW, et al. Synthesis, cytotoxicity, and mechanistic evaluation of tetrahydrocurcumin-amino acid conjugates as LAT1-targeting anticancer agents in C6 glioma cells. Int J Mol Sci. 2024;25(20):11266.
  19. Shihan MH, Novo SG, Le Marchand SJ, Wang Y, Duncan MK. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 2021;25:100916.
  20. Gomez-Dopazo G, Nieves RJA, Rivera RLA, et al. Cellulose acetate microwell plates for high-throughput colorimetric assays. RSC Adv. 2024;14(22):15319-15327.
  21. DuBreuil DM, Chiang BM, Zhu K, et al. A high-content platform for physiological profiling and unbiased classification of individual neurons. Cell Rep Methods. 2021;1(1).
  22. Ronzetti M, Simeonov A. A comprehensive update on the application of high-throughput fluorescence imaging for novel drug discovery. Expert Opin Drug Discovery. 2025;20(6):785-797.
  23. Jiang X, Li M, Wang Y, et al. 1,2,4,5-tetrazine-tethered probes for fluorogenically imaging superoxide in live cells with ultrahigh specificity. Nat Commun. 2023;14(1):1401.
  24. Yu Y, Chen J, Zhang X, et al. Identification of anti-inflammatory compounds from zhongjing formulae by knowledge mining and high-content screening in a zebrafish model of inflammatory bowel diseases. Chin Med. 2021;16(1):42.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ImagingworkflowcellevensvatbaarheidPI Hoechst kleuringHT22 cellenbeeldverwerkingsmethodenMulti Wavelength Cell ScoringLive Dead assayImageJ vergelijking
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen