Een geoptimaliseerd protocol voor een guidewire-geïnduceerd model van aortaklepstenose bij muizen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerd model voor aortaklepstenoze geïnduceerd door een geleidedraad in C57BL/6-muizen. Een op maat gemaakte, 3D-geprinte vasculaire ondersteuningsplatform maakt nauwkeurige bloedingscontrole mogelijk, wat resulteert in een overleving van 95% na 24 uur (19/20) en een algeheel succespercentage van het model van 90% na 4 weken (18/20).

Samenvatting

Aortaklepstenose (AVS) is een belangrijke cardiovasculaire aandoening met een toenemende prevalentie bij verouderende populaties, maar de schaarste aan zieke klepweefsels beperkt mechanistische studies en therapeutische ontwikkeling ernstig. Dit protocol stelt een reproduceerbaar muismodel voor AVS vast en optimaliseert dit door de methode van Honda voor door geleidedraad geïnduceerd klepslijtage te verbeteren via gecontroleerd bloedingsbeheer. Mannelijke en vrouwelijke C57BL/6 muizen ondergaan door geleidedraad geïnduceerde aortaklepbeschadiging; de procedure is verfijnd met een op maat gemaakt, 3D-geprint vasculair ondersteuningsplatform dat een precieze controle van de bloedingen mogelijk maakt tijdens de insertie en het terugtrekken van de geleidedraad. De uitkomstmaten omvatten de overleving na 24 h, echocardiografische beoordeling na 4 weken en histopathologische validatie. Het geoptimaliseerde protocol behaalt een overlevingspercentage van 95% na 24 h (19 van de 20 dieren); onder de overlevers voldoet 94,7% (18 van de 19) na 4 weken aan het vooraf gedefinieerde hemodynamische succescriterion, wat resulteert in een algeheel succespercentage van het model van 90% (18 van de 20 dieren), bevestigd door echocardiografie en histologische analyse. Dit gestandaardiseerde model biedt een betrouwbaar, reproduceerbaar platform voor het onderzoeken van mechanismen van klepdegeneratie en het evalueren van potentiële therapeutische interventies.

Inleiding

Hartklepaandoeningen blijven een aanzienlijke zorglast in zowel ontwikkelde als ontwikkelingslanden, waarbij de prevalentie parallel aan de vergrijzing van de bevolking toeneemt¹. Hoewel transcatheter aortaklepimplantatie (TAVI) de behandeling van ernstige aortastenose heeft getransformeerd^2,3, zijn de cellulaire en moleculaire mechanismen die klepdegeneratie aansturen nog onvolledig begrepen, en bestaat er geen goedgekeurde farmacologische therapie om de progressie van de ziekte te vertragen of om te keren^4,5. Een centraal obstakel in het onderzoek naar klepaandoeningen is de beperkte beschikbaarheid van ziek weefsel voor onderzoek^6,7. Menselijke aortakleppreparaten zijn moeilijk in voldoende hoeveelheid te verkrijgen, en diermodellen die pathologische klepveranderingen betrouwbaar nabootsen zijn even schaars geweest⁸. Deze leemte heeft geleid tot aanhoudende inspanningen om diermodellen te ontwikkelen die de hemodynamische en histologische kenmerken van aortaklepstenose (AVS) reproduceren.

Conventionele dieetbenaderingen, zoals langdurige voeding met een hoog vetgehalte bij ApoE⁻/⁻ muizen, vereisen 20–24 weken en hebben lage succespercentages, waarbij slechts een minderheid van de dieren een definitief stenotisch fenotype ontwikkelt^9,10,11,12. Het door een geleidedraad geïnduceerde klepbeschadigingsmodel beschreven door Honda et al. loste veel van deze tekortkomingen op door de klepbladen mechanisch te beschadigen via toegang via de arteria carotis¹³. De oorspronkelijke techniek omvat dissectie van de arteria carotis, retrograde passage van de geleidedraad naar de aortaklep, herhaaldelijk krassen van de klepbladen en rotatie van de draad—waardoor binnen enkele dagen snelle hemodynamische veranderingen optreden en er na 4 weken een stabiel stenotisch fenotype ontstaat^13,14,15,16. Vanwege de relatieve snelheid en directheid is de Honda-methode op grote schaal overgenomen in recent kleponderzoek. Er blijven echter enkele belangrijke hiaten bestaan. Volledige procedurele details zijn niet volledig gedocumenteerd in de literatuur, standaardisatie tussen laboratoria ontbreekt en de rol van bloedingscontrole—een belangrijke determinant van perioperatieve morbiditeit in dit model—is nooit systematisch behandeld. Deze inconsistenties verminderen de reproduceerbaarheid en beperken de klinische translatie.

Er werd gehypothetiseerd dat een systematische optimalisatie van de bloedingscontrole de perioperatieve overleving en de betrouwbaarheid van het model aanzienlijk zou kunnen verbeteren. Dit protocol presenteert een verfijnde en gestandaardiseerde aanpak die voortbouwt op de Honda-methode door de introductie van een op maat gemaakt, 3D-geprint vasculair ondersteuningsplatform. Het apparaat maakt instelbare longitudinale spanning op de arteria carotis mogelijk, waardoor volledige tijdelijke hemostase wordt bereikt tijdens het inbrengen en terugtrekken van de geleidedraad zonder het vat te pletten. Met deze aanpak bereikt het geoptimaliseerde protocol een overleving percentage van 95% na 24 u (19 van de 20 dieren); onder de overlevers voldoet 94,7% (18 van de 19) na 4 weken aan het vooraf gedefinieerde hemodynamische succes criterium, wat resulteert in een algemeen succes percentage van het model van 90% (18 van de 20 dieren). Stapsgewijze procedurele documentatie wordt verstrekt om de reproduceerbaarheid tussen laboratoria te vergemakkelijken.

Protocol

OPMERKING: Alle dierprocedures die in dit protocol worden beschreven, zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het West China Hospital (Protocol nr. 20240311055). Gedurende het gehele proces werden mannelijke C57BL/6 muizen (8–10 weken; ongeveer 22–25 g) en vrouwelijke C57BL/6 muizen (8–10 weken; ongeveer 18–20 g) gebruikt. Alle materialen, reagentia, instrumenten, software en aangepaste apparaten die in dit protocol worden gebruikt, inclusief het aangepaste 3D-geprinte vasculaire ondersteuningsplatform, staan vermeld in de Tabel met materialen.

1. Preoperatieve voorbereiding en chirurgische incisie

1. Anestheseer de muis met isofluraan (3% voor inductie, 1,5–2% voor instandhouding) verdampt in 100% zuurstof. Bevestig dat de anesthesiediepte adequaat is door te controleren op de afwezigheid van de pedicure withdrawreflex (teenknijptest).
   WAARSCHUWING: Isofluraan is een vluchtig anestheticum. Gebruik dit met actieve afzuiging of in een goed geventileerde ruimte, draag geschikte PBM en volg de institutionele veiligheidsprocedures.
2. Breng oogzalf aan in beide ogen. Plaats de muis in rugligging op een temperatuurgecontroleerd chirurgisch platform dat op 37 °C wordt gehouden.
3. Bereid het operatieveld voor door de anterieure cervicale regio te ontharen met een chemische ontharingscrème.
4. Desinfecteer de huid met drie opeenvolgende cycli van povidonjodium (of chloorhexidine) en 70% alcohol (of warme steriele zoutoplossing), waarbij wordt afgesloten met het antisepticum.
5. Infiltreer 0,5% lidocaïne subcutaan langs de geplande incisielijn voor preventieve lokale analgesie.
6. Maak vervolgens met microschaar een longitudinale mediane huidincisie (ongeveer 1,0–1,5 cm) in de voorzijde van de nek, net rechts van de tracheale middellijn.
   WAARSCHUWING: Microscharen, naalden, geleiders en andere scherpe voorwerpen kunnen letsel veroorzaken. Hanteer deze zorgvuldig en gooi gebruikte scherpe voorwerpen weg in goedgekeurde naaldencontainers.

2. Isolatie van het vat en plaatsen van de hechting

1. Leg onder een chirurgische stereomicroscoop de rechter gemeenschappelijke halsslagader (RCCA) vrij door middel van botte dissectie door de bovenliggende fascia en spierlagen. Scheid de RCCA voorzichtig van de aangrenzende nervus vagus en het omringende bindweefsel, waarbij zorgvuldig wordt vermeden dat de nervus vagus mechanisch geïrriteerd raakt.
   OPMERKING: Houd de speekselklieren en blootgestelde weefsels gedurende de gehele procedure vochtig met warme steriele zoutoplossing om uitdroging te voorkomen.
2. Ligeer het distale uiteinde van de RCCA permanent met een 6-0 zijden hechtdraad, vastgezet met een stevige, slipvrije knoop.
3. Plaats een losse schuifknoop van 6-0 zijden hechtdraad rond het proximale segment van de RCCA en laat deze ongespannen voor later gebruik tijdens de inbreng van de geleidingsdraad.

3. Toepassing van het platform en arteriotomie

OPMERKING: Steriliseer vóór de operatie het 3D-geprinte platform met ethyleenoxidegas (EtO), gevolgd door adequate beluchting, en steriliseer alle metalen chirurgische instrumenten door middel van autoclavering.

WAARSCHUWING: Ethyleenoxide is toxisch, ontvlambaar en carcinogeen. Gebruik EtO-sterilisatie alleen in goedgekeurde faciliteiten, zorg voor adequate beluchting en volg de institutionele procedures voor afvalverwerking.

1. Plaats het 3D-geprinte vasculaire ondersteuningsplatform voorzichtig onder het geïsoleerde segment van de RCCA, waarbij de omgekeerde V-vormige apex direct onder het vat wordt gepositioneerd.
2. Pas het platform langzaam aan om de longitudinale spanning op de RCCA te verhogen door de vooraf geplaatste hechtingen in opeenvolgend hogere zijinkepingen te haken.
   OPMERKING: De omgekeerde V-vormige apex is ontworpen met een hoek van 120° om zich aan de kromming van het vat aan te passen zonder de wand te pletten. Stop met het verhogen van de spanning op het exacte moment dat de arteriële pulsatie visueel niet meer waarneembaar is. Dit kritieke visuele eindpunt waarborgt tijdelijke hemostase zonder overmatige beschadiging van het vat.
3. Maak met microschaartjes een kleine transversale arteriotomie (ongeveer de helft van de omtrek van het vat) in het gestabiliseerde RCCA-segment. Er mag minimale of geen bloeding optreden als de spanning correct is ingesteld.

4. Inbrengen van de geleidedraad en klepbeschadiging

1. Voer onder microscopische visualisatie de geleidedraad (0,014 inch / 0,36 mm diameter) in retrograde richting naar de aortawortel in het arteriële lumen in via de transversale arteriotomie.
   OPMERKING: Dit kaliber is standaard voor gepubliceerde modellen van geleidedraadletsel en benadert de luminale diameter van de murine RCCA (~0,4–0,5 mm), wat resulteert in een verhouding tussen geleidedraad en vat van ongeveer 0,7–0,9.
   WAARSCHUWING: De geleidedraad kan vaten of omliggende weefsels doorboren. Voer de draad langzaam voort onder visualisatie en voer gebruikte geleidedraden af als scherpe voorwerpen of gecontamineerd chirurgisch afval.
2. Trek de vooraf geplaatste proximale schuifknoop rond zowel het vat als de geleidedraad aan om volledige hemostase op de insteekplaats te bereiken. Zodra de schuifknoop is vastgezet, wordt het 3D-geprinte platform voorzichtig onder het vat vandaan verwijderd.
   OPMERKING: Als er onverwachte bloedingen optreden tijdens de insertie, of als de diameter van de geleidedraad overmatige wrijving veroorzaakt, positioneer het platform dan tijdelijk opnieuw om de hemostase te ondersteunen, of verminder de spanning op het platform licht om het lumen van het vat te laten uitzetten voordat de insertie opnieuw wordt geprobeerd.
3. Voer de geleidedraad voorzichtig in retrograde richting voort door de RCCA, voorbij de aortaboog en richting de aortaklep. Bevestig onder real-time echocardiografische begeleiding dat de tip van de geleidedraad de aortaklep is gepasseerd en het linker ventrikel is binnengegaan.
4. Voer, terwijl de proximale schuifknoop volledig is aangetrokken om de hemostase te behouden, het mechanische klepletsel uit door 100 push-pull-bewegingen (heen en weer) over de aortaklep uit te voeren, gevolgd door 100 rotatiebewegingen van de geleidedraad tegen de klepbladen.
   OPMERKING: De 100 push-pull- en 100 rotatiebewegingen zijn via uitgebreide interne optimalisatie vastgesteld als de aantallen die de proceduretijd het beste balanceren met een betrouwbare inductie van hemodynamisch significante stenose.

5. Terugtrekken van de geleidingsdraad en wondsluiting

1. Trek na voltooiing van de klepbeschadiging de geleidingsdraad langzaam uit het vat.
2. Zet de proximale schuifknoop onmiddellijk om in een permanente, niet-glijdende knoop om de proximale RCCA af te binden en postprocedurele bloedingen te voorkomen.
3. Sluit de huidincisie met onderbroken 5-0 nylon hechtingen of chirurgische wondclips.
4. Dien postoperatief geen niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID's) toe. Dien perioperatief geen antibiotica toe, aangezien de procedure onder aseptische omstandigheden wordt uitgevoerd.
5. Plaats het dier in een schone, verwarmde herstelkooi en monitor het continu totdat de volledige mobiliteit is hersteld.

6. Echocardiografische evaluatie van de transvalvulaire hemodynamiek

1. Voer 4 weken na de operatie echocardiografische beoordelingen uit bij alle overlevende muizen om de ernst van de aortaklepstenose te evalueren.
2. Induceer anesthesie door het dier in een inductiekamer te plaatsen met 3% isofluraan in 100% zuurstof. Bevestig de anesthesiediepte door het verlies van de pedale terugtrekkreflexen te verifiëren. Depileer de voorste borstwand met een chemische ontharingscrème. Breng oogzalf aan in beide ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
3. Verplaats de geanestheseerde muis in rugligging naar een temperatuurgecontroleerd beeldplatform.
4. Bevestig de poten aan oppervlakte-elektroden voor het elektrocardiogram (ECG) voor continue hartslagmonitoring. Titreer de isofluraanconcentratie (typisch 1,0–1,5%) om een stabiele fysiologische hartslag van 450–550 slagen per min te handhaven.
5. Reinig de voorste borstwand en breng een royale laag voorverwarmde akoestische koppelingsgel aan.
6. B-mode beeldacquisitie
   1. Druk met een Vevo 3100 echografiesysteem met een MX550D transducer (40 MHz) op de B-Mode bediening om te beginnen met live tweedimensionale beeldvorming.
   2. Positioneer de transducer in de linker parasternale positie om een parasternaal long-as beeld van het linker ventrikel, de aortaklep en de aorta ascendens te verkrijgen. Optimaliseer de diepte, breedte en 2D gain.
7. M-mode acquisitie en meting van het linker ventrikel
   1. Druk vanuit het parasternale long-as beeld op de M-Mode bediening. Positioneer de bemonsteringslijn over het linker ventrikel op het niveau van de papillaire spieren.
   2. Druk op Start om de acquisitie te beginnen. Zodra er een stabiele curve is verkregen die over minstens drie hartcycli loopt, drukt u op Save.
   3. Gebruik in Vevo LAB de LV Trace-tool om het endocard te traceren bij de eind-diastole en eind-systole, en registreer de interne afmetingen van het linker ventrikel, de dikte van de voor- en achterwand (LVAWd, LVPWd) en de massa van het linker ventrikel.
8. Herpositioneer en kantel de transducer om een specifiek beeld van de aortaboog te verkrijgen.
   ​OPMERKING: Het verkrijgen van dit specifieke beeld van de aortaboog is essentieel voor nauwkeurige transvalvulaire snelheidsmetingen, omdat dit een optimale uitlijning van de echostraal met de richting van de bloedstroom over de aortaklep garandeert.
9. Color Doppler beoordeling
   1. Druk vanuit het beeld van de aortaboog op de Color bediening. Positioneer het kleurvenster over de aortaklep en de proximale aorta ascendens.
   2. Pas de kleurschaal en gain aan zodat de systolische jet duidelijk zichtbaar is zonder aliasing. Druk op Start en vervolgens op Save.
10. Pulsed-wave Doppler snelheidsmeting
    1. Druk op de PW Doppler bediening. Positioneer de sample-volume gate op het smalste punt van de jet (vena contracta) en pas hoekcorrectie toe (<60°).
    2. Druk op Start om de spectrale curve te beginnen; zodra er minstens drie hartcycli zijn geregistreerd, drukt u op Save. Meet in Vevo LAB de piek transvalvulaire snelheid met de Peak Velocity-tool, waarbij het gemiddelde van minstens drie cycli wordt berekend.

7. Histologische verwerking en kleuring van de aortawortel

1. Bevestig na de echocardiografische evaluatie de diepe anesthesie door de volledige afwezigheid van de pedaalreflex te verifiëren. Voer cervicale dislocatie uit als secundaire methode van euthanasie, in overeenstemming met de AVMA-richtlijnen voor de euthanasie van dieren (editie 2020) en institutioneel goedgekeurde protocollen.
   WAARSCHUWING: Dierlijke karkassen, weggesneden weefsels en met bloed besmette materialen zijn biologisch/dierlijk afval. Voer de verwijdering uit volgens de institutionele biosafety- en dierfaciliteitsvoorschriften.
2. Voer een thoracotomie uit met chirurgische microschaaren om het hart bloot te leggen.
3. Plaats een perfusienaald in de apex van de linker ventrikel en spoel de systemische circulatie met koud steriel fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Een succesvolle perfusie wordt aangegeven door het bleek worden van de lever en de longen.
4. Snijd het intacte hart uit en dompel het gedurende minimaal 24 h bij kamertemperatuur onder in 4% paraformaldehyde (PFA) om volledige fixatie te waarborgen.
   WAARSCHUWING: Paraformaldehyde is toxisch en irriterend. Hanteer 4% PFA in een chemische zuurkast met geschikte PBM en voer PFA-afval af als gevaarlijk chemisch afval.
5. Breng het gefixeerde weefsel over naar een automatische weefselprocessor voor sequentiële dehydratatie via een gradiënt van ethanolseries, gevolgd door klaring met xyleen en infiltratie met paraffine bij 65 °C.
   WAARSCHUWING: Xyleen is brandbaar en toxisch, en hete paraffine kan brandwonden veroorzaken. Hanteer xyleen in een zuurkast of goedgekeurde processor en voer xyleenhoudend afval af als gevaarlijk chemisch afval.
6. Bed het verwerkte hart in paraffineblokken.
   OPMERKING: De juiste oriëntatie van het hart bij het embedden is cruciaal. Positioneer het hart zodanig dat transversale doorsneden door de aortawortel op het niveau van de drie klepbladen mogelijk zijn.
7. Maak met een rotatiemicrotoom seriële dwarsdoorsneden met een dikte van 4–5 µm door het vlak van de aortaklep, waarbij wordt gewaarborgd dat alle drie de klepbladen worden meegenomen. Monteer de coupes op glazen objectglazen en bewaar deze bij kamertemperatuur.
8. Voer Hematoxyline en Eosine (H&E) kleuring uit op geselecteerde coupes om de weefselmorfologie, structurele remodellering en de dikte van de klepbladen te beoordelen.
9. Voer Von Kossa-kleuring uit op aangrenzende seriële coupes om dystrofische calcificatie te detecteren en te kwantificeren, wat identificeerbaar is als donkerbruine tot zwarte mineraalafzettingen in de klepbladen.

8. Sham-operatie

OPMERKING: Deze sectie beschrijft de procedure voor de sham-controle. Sham-muizen ondergaan dezelfde anesthesie, huidpreparatie, bloedvatblootstelling, arteriotomie en retrograde invoering van de geleidedraad als de groep met aortadraadlezie (AWI); de geleidedraad wordt tot op supravalvulair niveau gevorderd maar wordt niet door de aortaklep gevoerd, en er wordt geen mechanische kleplezie veroorzaakt.

1. Anestheseer de muis en bereid het operatieveld voor zoals beschreven in stappen 1.1 tot en met 1.5.
2. Leg de RCCA bloot via botte dissectie onder stereomicroscopische visualisatie, zoals beschreven in stap 2.1.
3. Ligeer het distale uiteinde van de RCCA permanent met een 6-0 zijden hechtdraad en plaats een losse proximale schuifknoop (zoals in stappen 2.2–2.3).
4. Voer de transversale arteriotomie uit en voer de geleidedraad in zoals beschreven in stappen 3.1–4.2.
5. Voer de geleidedraad onder echocardiografische begeleiding in retrograde richting voort tot het supravalvulaire niveau van de aorta ascendens, waarbij moet worden bevestigd dat de punt van de geleidedraad de aortaklep NIET passeert.
   OPMERKING: Voer de push-pull of roterende bewegingen die de klep kunnen beschadigen, zoals beschreven in stap 4.4, NIET uit. Trek de geleidedraad terug en ligeer onmiddellijk de proximale RCCA zoals beschreven in stappen 5.1–5.2.
6. Sluit de huidincisie met onderbroken 5-0 nylon hechtingen of wondclips.
   OPMERKING: Net als bij de AWI-groep wordt de intraoperatieve analgesie verzorgd door lokale infiltratie van lidocaïne (stap 1.5). Plaats het dier in een verwarmde herstelkooi en monitor het dier totdat het volledig mobiel is.
7. Onderwerp de Sham-muizen aan dezelfde postoperatieve monitoring, echocardiografische evaluatie na 4 weken en histologische verwerking als de AWI-groep.

9. Statistische analyse en studieopzet

1. Gedurende de studie werden 20 muizen (10 mannelijk, 10 vrouwelijk) onderworpen aan de AWI-procedure, en 6 C57BL/6-muizen (3 mannelijk, 3 vrouwelijk) aan de Sham-procedure.
2. Meet de piektransvalvulaire snelheid (het criterium dat het succes van het model definieert) bij alle overlevende dieren (19 AWI, 6 Sham).
3. Analyseer gedetailleerde echocardiografische en histologische indices in een vooraf vastgestelde, op geslacht gebalanceerde subgroep van 6 AWI-muizen (3 mannelijk, 3 vrouwelijk).
4. Zorg ervoor dat alle echocardiografische en histologische metingen worden uitgevoerd door onderzoekers die geblindeerd zijn voor de groepsindeling.
5. Beoordeel de data op normaliteit met de Shapiro-Wilk-test voorafgaand aan parametrische toetsing. Vergelijk twee onafhankelijke groepen (AWI vs. Sham) met behulp van een ongepaarde tweezijdige Student's t-test.
6. Analyseer en presenteer overlevingsdata met de Kaplan-Meier-methode.
7. Voer alle analyses uit in GraphPad Prism. Presenteer data als gemiddelde ± SEM, waarbij p < 0,05 als statistisch significant wordt beschouwd.

Resultaten

Ontwikkeling van een 3D-geprint platform voor bloedingscontrole

Om perioperatieve bloedingen aan te pakken — de belangrijkste bron van morbiditeit en mortaliteit in het conventionele guidewire-geïnduceerde AVS-model — is een 3D-geprint vasculair ondersteuningsplatform ontworpen (Figuur 1). Het platform werd gefabriceerd via stereolithografie (SLA)-printen met een biocompatibele (USP Class VI / ISO 10993-conforme) fotopolymeerhars, met een structurele dikte van 1,07 mm. Na het printen werden de onderdelen gewassen in isopropylalcohol om niet-uitgeharde hars te verwijderen en vervolgens nagehard onder ultraviolet licht. Het volledige ontwerpbestand (.stp) is beschikbaar zodat het platform kan worden gereproduceerd op standaard SLA-systemen. Het platform is voorzien van een omgekeerd V-vormig apicaal oppervlak met een apexhoek van 120° (Figuur 1A–B), dat zich vormt naar de kromming van de geïsoleerde rechter arteria carotis communis zonder overmatige compressie van de vaatwand te veroorzaken. Meerdere trapsgewijze zijinkepingen (Figuur 1C–D) stellen de operator in staat om de vooraf geplaatste hechtingen vast te pakken en instelbare longitudinale spanning op het vat uit te oefenen. De spanning wordt stapsgewijs verhoogd totdat de arteriële pulsatie niet langer zichtbaar is — een visueel eindpunt dat duidt op adequate tijdelijke hemostase. Deze aanpak biedt een stabiel chirurgisch veld voor de arteriotomie en de inbreng van de guidewire, terwijl overmatige crush-letsels aan de vaatwand worden voorkomen.

Intraoperatieve bevestiging van de positionering van de geleidedraad

De correcte plaatsing van de geleidedraad werd tijdens de procedure in twee fasen geverifieerd. Ten eerste werd onder directe stereomicroscopische visualisatie waargenomen dat de geleidedraad in retrograde richting via de transversale arteriotomie het lumen van de RCCA binnenging (Figuur 2A). Ten tweede bevestigde real-time echocardiografische beeldvorming dat de tip van de geleidedraad de aortaklep was gepasseerd en de linker ventrikel was binnengegaan. B-mode beeldvorming identificeerde de geleidedraad als een hyperechoïen lineair artefact dat het vlak van de aortaklep doorkruiste (Figuur 2B). Color Doppler-beeldvorming toonde gelokaliseerde turbulente stroom op het niveau van de aortaklep, wat aanvullende bevestiging gaf van de positionering van de geleidedraad over de klepbladen (Figuur 2C; Aanvullende Video 1).

Perioperatieve overleving en succespercentage van het model

De integratie van het spanningsregelbare platform in de chirurgische workflow resulteerde in een hoge vroege overleving. Kaplan-Meier-analyse toonde een overlevingspercentage van 95% aan 24 u postoperatief (19 van de 20 muizen; Figuur 3A). Post-mortem onderzoek van de enige niet-overlevende muis wees geen bewijs van grote bloedingen, structurele schade of cardiale ischemie, wat suggereert dat de dood te wijten was aan complicaties gerelateerd aan de anesthesie en niet aan chirurgisch trauma. Het succes van het model na 4 weken werd geëvalueerd aan de hand van een vooraf gedefinieerd criterium: een piektransvalvulaire stroomsnelheid die 2.000 mm/s overschreed, samen met ondersteunende histologische bevindingen. Van de 19 overlevende dieren behaalden er 18 (94,7%) deze drempelwaarde, wat leidde tot een algemeen succespercentage van het model van 90% over de gehele cohort (18 van de 20 muizen; Figuur 3B). De resultaten waren vergelijkbaar tussen de geslachten: de overleving na 24 u was 9 van de 10 bij mannetjes en 10 van de 10 bij vrouwtjes, en het succespercentage van het model na 4 weken was bij beide geslachten 9 van de 10 (90%); de enige perioperatieve sterfte betrof een mannetje (anesthesie-gerelateerd) en het enige falen van het model betrof een overlevend vrouwtje.

Echocardiografische bevestiging van aortastenose

Transthoracale echocardiografie 4 weken na de operatie bevestigde hemodynamische veranderingen die consistent waren met ernstige aortastenose in de AWI-groep. Kwantitatieve echocardiografische waarden worden weergegeven als het gemiddelde ± de standaardfout van het gemiddelde (SEM); parameters voor de functie en remodellering van de linker ventrikel werden geanalyseerd bij 6 Sham- en 6 AWI-muizen, terwijl de maximale transvalvulaire snelheid werd gemeten bij alle overlevende AWI-muizen en Sham-controles (n = 19 AWI, n = 6 Sham). De ejectiefractie van de linker ventrikel was in de AWI-groep na 4 weken licht lager dan in de Sham-controles (56,21 ± 1,15% vs. 61,57 ± 2,12%; p = 0,0503; Figuur 3C), een verschil dat geen statistische significantie bereikte. Pulsed-wave Doppler-registraties toonden een aanzienlijke toename van de transvalvulaire jet-snelheid in de AWI-groep, die 2740,89 ± 104,10 mm/s bereikte, vergeleken met 988,00 ± 126,24 mm/s in de Sham-controlegroep (Figuur 3D). Kwantitatieve analyse bevestigde een zeer significante verhoging van de maximale transvalvulaire jet-snelheid in de AWI-groep ten opzichte van de Sham-controles (p < 0,0001; Figuur 3E). Consistent met een vroege fase van drukoverbelastingsadaptatie vertoonde de AWI-groep concentrische remodellering van de linker ventrikel: de diastolische wanddikte van de voorwand was significant toegenomen (LVAWd 1,14 ± 0,02 vs. 0,96 ± 0,03 mm; p = 0,0016; Figuur 3F), terwijl de diastolische wanddikte van de achterwand en de massa van de linker ventrikel hoger waren, maar geen statistische significantie bereikten (LVPWd 1,01 ± 0,12 vs. 0,76 ± 0,02 mm, p = 0,0650, Figuur 3G; LV-massa 124,51 ± 10,63 vs. 104,47 ± 2,45 mg, p = 0,0961, Figuur 3H).

Histopathologische validatie van klepremodellering en calcificatie

Histologisch onderzoek van de aortawortels bevestigde de echocardiografische bevindingen. Kwantitatieve histologische waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SEM en werden geanalyseerd bij 6 Sham- en 6 AWI-muizen. H&E-kleuring in de AWI-groep toonde een uitgesproken verdikking van de klepbladen en structurele desorganisatie, kenmerken die afwezig waren bij de Sham-controles (Figuur 3I). Kwantitatieve morfometrie bevestigde een significante toename van de gemiddelde dikte van de klepbladen in de AWI-groep vergeleken met de Sham-groep (p < 0,0001; Figuur 3J). Von Kossa-kleuring toonde uitgebreide dystrofe calcificatie aan binnen de verdikte klepbladen van de AWI-groep, geïdentificeerd als donkerbruine tot zwarte mineraalafzettingen. Sham-controles vertoonden verwaarloosbare mineraalafzetting (Figuur 3K). Kwantitatieve beeldanalyse onthulde een significante toename van het totale calcificatieoppervlak (µm²) in de AWI-groep ten opzichte van de Sham-controles (p < 0,0001; Figuur 3L).

Figuur 1: Ontwerp van het 3D-geprinte vasculaire ondersteuningsplatform weergegeven in vier aanzichten. (A) Schuin vooraanzicht links. (B) Schuin achteraanzicht rechts. (C) Lateraal profielaanzicht van de algemene longitudinale geometrie van het platform. (D) Gehoekt aanzicht met nadruk op de omgekeerde V-vormige apexregio. Componentlabels: 110, platformlichaam; 120, laterale armen; 121, trapsgewijze zijdelingse inkepingen; 130, werkende zijde; 140, omgekeerde V-vormige insertie-apex; 150, met het vat contacterende ondersteuningsvlak; 160, overgangshelling tussen aangrenzende inkepingen; 190, rechter arteria carotis communis (RCCA). Het platform is gefabriceerd uit biocompatibele fotopolymeerhars (structurele dikte: 1,07 mm). De 3D-structuurtekening is door de auteurs gegenereerd vanuit het originele CAD-ontwerpbestand (.stp) van het vasculaire ondersteuningsplatform met behulp van FreeCAD, een gratis en open-source CAD-visualisatie- en modelleringssoftware. Er is geen gebruikgemaakt van publicaties of auteursrechtelijk beschermde tekeningen van derden. Het originele CAD-ontwerpbestand is beschikbaar als aanvullend bestand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Intraoperatieve en echocardiografische bevestiging van de positie van de geleidedraad. (A) Intraoperatieve foto waarop de retrograde inbreng van de geleidedraad (pijl) door de transversale arteriotomie in het lumen van de rechter arteria carotis communis (RCCA) te zien is onder directe stereomicroscopische visualisatie. (B) B-mode echocardiografisch beeld waarop de geleidedraad (geïdentificeerd als een hyperechoïsch lineair artefact; pijl) de aortaklep passeert en het linker ventrikel binnengaat. (C) Color Doppler echocardiografisch beeld dat een gelokaliseerde turbulente stroom op het niveau van de aortaklep aantoont, wat de positie van de geleidedraad door de klepbladen bevestigt. Real-time Color Doppler visualisatie van de transvalvulaire stroom tijdens het positioneren van de geleidedraad is te zien in Aanvullende Video 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Overleving, hemodynamische, ventriculaire remodellering en histopathologische resultaten van het geoptimaliseerde aortic wire injury (AWI) model. (A) Kaplan-Meier 24 u overlevingscurve van AWI-muizen (n = 20). (B) Succes (rood) versus falen (zwart) van het model in de AWI-groep na 4 weken (n = 20); succes werd gedefinieerd als een piek transvalvulaire snelheid > 2.000 mm/s. (C) Ejectiefractie (EF; p = 0,0503). (D) Representatieve pulsed-wave (PW) Doppler echocardiogrammen van een Sham-muis (links) en een AWI-muis (rechts). (E) Piek transvalvulaire snelheid (n = 19 AWI, n = 6 Sham; p < 0,0001). (F) Diastolische dikte van de voorwand van het linker ventrikel (LVAWd; p = 0,0016). (G) Diastolische dikte van de achterwand van het linker ventrikel (LVPWd; p = 0,0650). (H) Massa van het linker ventrikel (p = 0,0961). (I) Representatieve HE-gekleurde coupes van de aortawortel (Sham, links; AWI, rechts). (J) Dikte van de aortaklepbladjes (p < 0,0001). (K) Representatieve Von Kossa-gekleurde coupes van de aortawortel (Sham, links; AWI, rechts). (L) Totale calciumafzettingsoppervlakte (µm²; p < 0,0001). Schaalbalken = 500 µm. Voor alle kwantitatieve staafdiagrammen vertegenwoordigen de staven de gemiddelde waarden en de foutenbalken de standaardfout van het gemiddelde (SEM). Kwantitatieve vergelijkingen tussen de Sham- en AWI-groepen in panelen C, E–H, J en L werden uitgevoerd met een ongepaarde tweezijdige Student's t-test. Kwantitatieve gegevens zijn afkomstig van de Sham- en AWI-groepen (n = 6 per groep), behalve voor de piek transvalvulaire snelheid in paneel E, die werd gemeten bij alle overlevende AWI-muizen en Sham-controles (n = 19 AWI, n = 6 Sham). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende video 1: Kleuren-dopplerechocardiografische visualisatie van de transvalvulaire bloedstroom tijdens de positionering van de geleidedraad. De video toont real-time kleuren-dopplerbeelden op het niveau van de aortaklep tijdens de AWI-procedure, waarbij lokale turbulente stroming zichtbaar is die wordt veroorzaakt door de positionering van de geleidedraad door de klepbladen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Dit protocol biedt een gedetailleerde beschrijving van een stabiel en veilig diermodel voor aortastenose. Een kenmerk van deze aanpak is een hulpplatform dat de inbreng van een geleidedraad in de arteria carotis communis vergemakkelijkt. Het platform is gefabriceerd via stereolithografie (SLA)-printen met een biocompatibele fotopolymeerhars (structurele dikte 1,07 mm) en bevat een omgekeerd V-vormig apicaal oppervlak met een apexhoek van 120°; het volledige ontwerpbestand is vrij beschikbaar als een aanvullend .stp-bestand. Dit hulpmiddel waarborgt een soepele toegang van de geleidedraad, beheerst het perioperatieve bloedverlies op objectieve wijze en beschermt daarmee zowel de korte- als langetermijnoverleving van de modelmuizen. Sinds de oorspronkelijke beschrijving is het door geleidedraden geïnduceerde model verder verfijnd en gekarakteriseerd, inclusief varianten met gradaties in ernst waarbij de intensiteit van de beschadiging wordt getitreerd om milde tot ernstige stenose te produceren¹⁷, en recente rapporten waarin de perioperatieve complicaties worden gedocumenteerd¹⁸; het huidige protocol bouwt voort op dit werk door perioperatieve hemorragie systematisch aan te pakken.

Verschillende stappen in dit protocol zijn cruciaal voor een succesvolle inductie van het model en verdienen bijzondere aandacht. Ten eerste moet de mate van longitudinale spanning die via het 3D-geprinte platform wordt uitgeoefend, nauwkeurig worden gekalibreerd: de spanning mag alleen worden verhoogd totdat de arteriële pulsatie visueel niet meer waarneembaar is. Onvoldoende spanning leidt tot aanhoudende bloedingen tijdens de arteriotomie, terwijl overmatige spanning het risico op endotheelschade en vaatscheuring met zich meebrengt. Ten tweede moet de proximale schuifknoop stevig worden aangetrokken rond zowel het vat als de geleidingsdraad voordat het platform wordt verwijderd; voortijdige verwijdering van het platform met een onvoldoende vastgezette schuifknoop is de meest voorkomende oorzaak van bloedingen tijdens de procedure. Ten derde is de bevestiging van de entry van de geleidingsdraad in de linker ventrikel onder echocardiografische begeleiding essentieel. Zonder deze verificatiestap kan de operateur er niet zeker van zijn dat de geleidingsdraad correct is gepositioneerd bij de aortaklep, en zal een incomplete beschadiging leiden tot het falen van het model.

Verschillende veelvoorkomende complicaties kunnen worden voorzien en beheerst. Als er bloedingen optreden tijdens de inbrenging van de geleidedraad, moet het platform opnieuw onder het vat worden gepositioneerd om tijdelijke hemostase te herstellen voordat men verdergaat. Bij dieren met halsslagaders van een kleiner kaliber kan het licht verminderen van de platformsspanning het vatlumen verbreden om de geleidedraad te accommoderen. Dit model kent enkele beperkingen die in overweging moeten worden gebracht bij de interpretatie van de resultaten. De mechanische draadbeschadiging veroorzaakt acute mechanische en inflammatoire klepbeschadiging, wat verschilt van het chronische, lipidengedreven degeneratieve proces dat kenmerkend is voor menselijke calcificerende aortastenose^17,19,20,21. Bijgevolg kunnen de histologische kenmerken — hoewel ze verdikking van de klepbladen en dystrofische calcificatie reproduceren — mogelijk niet alle moleculaire gebeurtenissen van de menselijke ziekte volledig nabootsen. Het protocol is ontwikkeld en gevalideerd in zowel mannelijke als vrouwelijke C57BL/6-muizen in de leeftijd van 8–10 weken; de toepasbaarheid op andere stammen of oudere dieren vereist echter onafhankelijke validatie. Seks-gerelateerde verschillen in de diameter van de halsslagader en de cardiale anatomie kunnen de chirurgische moeilijkheidsgraad en hemodynamische uitkomsten beïnvloeden; onderzoekers worden aangemoedigd om geslacht als biologische variabele te rapporteren in downstream-analyses²². Daarnaast is permanente ligatie van de rechter arteria carotis communis inherent aan de procedure; hoewel de Circle of Willis zorgt voor collaterale cerebrale perfusie bij muizen en er geen evidente neurologische defecten werden waargenomen, kunnen subtiele cognitieve of cerebrovasculaire effecten niet worden uitgesloten. Baseline (pre-procedure) echocardiografie is niet uitgevoerd; de gelijktijdige sham-groep diende als controle voor normale klepfunctie, en een baseline-scan wordt aanbevolen waar mogelijk om intra-dier vergelijking mogelijk te maken en te screenen op de zeldzame spontane aortaklepafwijkingen die zijn gerapporteerd bij C57BL/6-muizen (~0,3% in ongemodificeerde stammen). Aortainsufficiëntie is in deze studie niet systematisch beoordeeld; de frequentie van door letsel geïnduceerde aortainsufficiëntie en de relatie hiervan met de ernst van de stenose rechtvaardigen een specifieke evaluatie en zullen in toekomstig werk worden behandeld.

Mogelijke nadelen van het platform moeten ook in overweging worden genomen. Het apparaat zou aangrenzende structuren mechanisch kunnen irriteren, waaronder de nervus vagus die langs de arteria carotis loopt; dit risico wordt geminimaliseerd door de afgeronde, stompe randen van het platform, de vaatconforme apex van 120° en de korte applicatietijd, en in deze studie werden geen respiratoire afwijkingen of andere evidente complicaties waargenomen die aan het apparaat konden worden toegeschreven. Vergeleken met gevestigde alternatieve benaderingen biedt dit geoptimaliseerde protocol verschillende praktische voordelen. Dieetmodellen bij ApoE⁻/⁻ muizen vereisen 20–24 weken vetrijk voer en resulteren in variabele stenotische fenotypen, waarbij veel dieren geen hemodynamisch significante ziekte ontwikkelen. Het huidige protocol produceert binnen 4 weken een consistent stenotisch fenotype, met een algeheel succespercentage van 90% (18 van de 20 dieren). Vergeleken met de oorspronkelijke Honda-geleidedraadmethode is de belangrijkste verbetering van dit protocol de systematische beheersing van perioperatieve bloedingen via het 3D-geprinte platform.

Hemorragie tijdens de insertie van de geleidingsdraad is erkend als een complicatie van de oorspronkelijke techniek, maar is onvoldoende aangepakt. In de retrospectieve ervaring van hetzelfde laboratorium met de conventionele (pre-platform) procedure (meer dan 400 gevallen) trad in naar schatting ~40% van de gevallen een majeure intraoperatieve hemorragie op, met een post-hemorragische mortaliteit van ~60% en een overleving na 24 h van ~75%, waarbij hemorragie — voornamelijk op de toegangsplaats van de arteria carotis — verantwoordelijk was voor vrijwel alle perioperatieve sterfgevallen. Dit is consistent met Qian et al., die bloedingen op de punctieplaats van de arteria carotis identificeerden als de belangrijkste oorzaak van perioperatieve sterfte in dit model. Door het bloedverlies te beheersen, verhoogde het 3D-geprinte platform de overleving na 24 uur tot 95%, waarbij in de huidige cohort geen sterfgevallen als gevolg van hemorragie werden waargenomen. Omdat hemorragie niet langer de beperkende factor is, kan de intensiteit van het mechanische letsel worden gevarieerd om een gradatie in de ernst van de stenose te produceren. Deze instelbaarheid heeft directe translationele relevantie: voor kandidaat-therapeutica met bescheiden effectgroottes kan een ernstiger basisonderzoek noodzakelijk zijn om behandelingsgerelateerde verschillen bloot te leggen die anders in een milder model verborgen zouden blijven.

Dit model is zeer geschikt voor verschillende categorieën vervolgonderzoek. Omdat het stenotisch fenotype zich ontwikkelt binnen een gedefinieerd en reproduceerbaar tijdsbestek, kan het dienen als platform voor de preklinische evaluatie van kandidaat-farmacologische therapieën die erop gericht zijn klepcalcificatie of fibrose te vertragen²³. Het model is ook compatibel met genetische benaderingen: het protocol kan worden toegepast op transgene of knockout-muizen op de C57BL/6-achtergrond om de bijdrage van specifieke signaleringspaden aan de progressie van klepziekten te ontleden. Daarnaast biedt het eindpunt van 4 weken een praktisch venster voor seriële echocardiografische monitoring van de ziekte-evolutie of de respons op een behandeling. De ontwerpbestanden voor het 3D-geprinte platform kunnen vrij worden gedeeld als een aanvullend .stp-bestand, en de standaardisatie van dit apparaat tussen laboratoria wordt verwacht de reproduceerbaarheid tussen verschillende locaties verder te verbeteren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3D-geprint vasculair ondersteuningsplatform	Op maat gemaakt	N/A	Op maat gemaakt 3D-geprint vasculair ondersteuningsplatform; aanvullend CAD-bestand geleverd in .stp-formaat.
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101-3ML	Weefselfixatie
5-0 nylonhechtdraad	Jinhuan Medical	F503	Huidsluiting middels onderbroken hechtingen
6-0 zijdehechtdraad	Jinhuan Medical	RC411	Permanente ligatie van de distale RCCA en proximale slipknoop
Akoestische koppelingsgel (voorverwarmd)	Keppler	KL-250	Echocardiografie
Biocompatibele fotopolymeerhars	Formlabs	RS-F2-BMCL-01	SLA-printmateriaal gebruikt voor de fabricage van het op maat gemaakte 3D-geprinte vasculaire ondersteuningsplatform.
C57BL/6 muizen (8–10 weken; mannetjes 22–25 g, vrouwtjes 18–20 g)	GemPharmatech	C57BL/6	Beide geslachten gebruikt; gehuisvest onder standaardcondities
Ethyleenoxidegas	Institutionele sterilisatiefaciliteit	N/A	Sterilisatie van het op maat gemaakte 3D-geprinte vasculaire ondersteuningsplatform.
FreeCAD	FreeCAD Project Association	1.1.1	CAD-visualisatie en generatie van de 3D-structuurtekening vanuit het .stp-bestand.
GraphPad Prism	GraphPad Software	9.0	Statistische analyse en grafieken
Geleidedraad, 0,014-inch diameter	Boston Scientific	H749393071900	Mechanische aortaklepbeschadiging
Hematoxyline en eosine (H&E) kleuringskit	Beyotime	C0105S	Morfologie en dikte van de klepbladen
Isofluraan	RWD Life Science	R510-22-2	3% inductie; 1,5–2% onderhoud in 100% O2
Lidocaïne	Shijiazhuang Pharmaceutical Group	H14024045	Preventieve lokale infiltratie op de incisieplaats (0,5%, stap 1.5)
Microsurgical schaar	RWD Life Science	F11022-11	Huidincisie, arteriotomie, thoracotomie
MX550D transducer (40 MHz)	FUJIFILM VisualSonics	MX550D	Echocardiografie
Nair ontharingscrème	Nair	255 g	Voor depilatie van de anterior cervicale regio en de borstwand
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)	Servicebio	G4202-100ML	Perfusie
Rotatiemicrotoom	Leica Biosystems	RM2125 RTS	Seriële coupes van 4–5 µm
Stereomicroscoop (chirurgisch)	Olympus	SZX7	Vatisolatie en microschirurgie
Vevo 3100 high-resolution ultrasoonsysteem	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 3100	Echocardiografie
Von Kossa kleuringskit	Servicebio	G1043-20ML	Detectie van dystrofe calcificatie
Xyleen	Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd.	C0430530209	Weefselklaring tijdens paraffineverwerking.