Het analyseren van genexpressie van Marine microbiële gemeenschappen met behulp van het milieu transcriptomics

Deze procedure begint met het verkrijgen van mariene microbiële biomassa uit watermonsters door voorfiltratie via vijf en drie micrometer filters, gevolgd door opvang op een 0,22 micrometer filter. Totaal RNA wordt vervolgens geëxtraheerd uit de organismen die op het 0,22 micrometer filter zijn achtergebleven. Ons RNA wordt uit het totaal RNA verwijderd door selectieve enzymatische degradatie en subtractieve hybridisatie, waarna verrijkt Mr.N lineair wordt geamplificeerd via polyA-tailing en in vitro transcriptie.

Het geamplificeerde antisense-RNA wordt vervolgens met behulp van random hexameren omgezet in dubbelstrengs cDNA. Het resulterende cDNA kan worden gekloond en gesequenced of direct pyro-gesequenced worden. Hallo, ik ben Rachel Persky van het laboratorium van Dr. Marianne Moran aan de afdeling Marine Sciences van de University of Georgia.

Vandaag laten we u een procedure zien om genexpressie in milieumonsters te bestuderen middels omgevingsmetatranscriptomics. Scott Gifford zal u laten zien hoe u milieumonsters verwerkt voor de RNA-extractie.

Ik zal laten zien hoe u RNA uit de monsters extraheert en de RIN-waarden bepaalt. AON zal de RNA-verwijdering demonstreren. Maria Kosta zal vervolgens de stappen voor RNA-amplificatie en cDNA-synthese doorlopen.

Laten we beginnen. Om te starten met de collectie van milieu-RNA, stellen we het filtersysteem in door één uiteinde van de slang in het water te plaatsen op de gewenste diepte voor bemonstering en het andere uiteinde te bevestigen aan een hoog-volume 3 µm filter, waarbij de pomp tussen de twee uiteinden van de slang wordt geplaatst. Het 3 µm filter wordt vervolgens verbonden met de 0,22 µm filtertoren en de uitstroom wordt van de 0,22 µm toren naar een maatcilinder geleid.

Spoel het systeem door door er enkele liters water doorheen te laten lopen. Verwijder na voltooiing de slang uit het water terwijl de pomp draait om het resterende water uit de leiding te verwijderen. Plaats vervolgens met een pincet een 0,22 micrometer filter op de filtertoren en sluit deze.

Plaats het uiteinde van de slang terug in het water en zet de pomp aan. Laat de lucht uit beide filters ontsnappen en houd het volume gefilterd water in de gflesse in de gaten. Zodra het gewenste volume is gefilterd, verwijdert u de slang uit het water en spoelt u het resterende water uit het systeem.

Zodra het filter droog is, verwijdert u snel de bovenste filterplaat en vouwt u het filterpapier. Plaats het filter in een whirl pack en vries het direct in met vloeibare stikstof. Voordat we met het experiment beginnen, is het belangrijk op te merken dat omdat RNA's alomtegenwoordig zijn en mRNA's snel degraderen, de standaard voorzorgsmaatregelen voor het werken in een ribonuclease-vrije omgeving moeten worden nageleefd, inclusief voor werkoppervlakken en pipetten.

Met dit in gedachten moeten schone handschoenen worden gedragen bij het hanteren van alle materialen die in deze procedure worden gebruikt. Daarnaast moeten monsters zo kort mogelijk worden verwerkt. Om te beginnen met de totale RNA-extractie uit het 0,22 micrometer filter, bereiden we bead-beating-buisjes voor door acht milliliter RLT-buffer met toegevoegde beta-mercaptoethanol aan een conische buis van 50 milliliter toe te voegen.

Voeg vervolgens één tot twee milliliter RNA-beads uit een mobile power soil extraction kit toe. Haal het bevrozen filter snel uit de vriezer en houd het in de world pack. Verbrijzel het met een hamer.

Voeg het verbrijzelde filter toe aan de voorbereide 50 milliliter conische buis en sluit het dopje van de buis af met Parafilm of laboratoriumtape; vortex gedurende 10 minuten. Centrifugeer vervolgens de 50 milliliter buis gedurende één minuut bij 5.000 RPM. Verwijder bij kamertemperatuur zoveel mogelijk van het lysaat en breng dit over naar een 15 milliliter buis voordat u opnieuw vijf minuten centrifugeert.

Bij 5.000 ×g wordt de supernatant overgebracht naar een nieuwe buis van 50 milliliter en wordt één volume 100% ethanol aan het lysaat toegevoegd. Gebruik een spuit van 10 milliliter om het lysaat via een naald van 18 tot 21 gauge op te zuigen en voer dit ongeveer vijf keer terug. Voor de volgende extractiestappen wordt de KaiGen R and easy mini kit gebruikt volgens de instructies van de fabrikant, waarbij het lysaat op de meegeleverde kolom wordt aangebracht met behulp van het vacuümsysteem of via herhaalde centrifugatie.

Kwantificeer het totale RNA spectrofotometrisch. Na het bepalen van de totale RNA-opbrengst gebruiken we de Ambien turbo DNA free kit volgens de instructies van de fabrikant om eventuele DNA-contaminaties te verwijderen. Nu de RNA-extracties voltooid zijn, draag ik het totale RNA over aan Johanna, die de eerste en tweede stappen voor de rRNA-verwijdering zal uitvoeren.

Bedankt Rachel. Om te beginnen met de rRNA-verwijdering, mengt u de 10x reactiebuffer voorzichtig en centrifugeert u deze kort voor gebruik. Combineer in een steriele RNA-vrije buis van 0,5 milliliter de juiste volumes van de 10x reactiebuffer, RNA-inhibitor, het totale RNA-monster en terminator-exonuclease. Volgens het Epicentre-protocol incubeert u de reactie 60 minuten bij 30 °C in een thermocycler met verwarmde kap of in een waterbad.

Beëindig vervolgens de reactie met een fenol-ethanolprecipitatie door eerst RNAse-vrij water toe te voegen tot een totaalvolume van 200 µL en daarna één volume van een één-op-één fenol-chloroformoplossing toe te voegen aan het mRNA-centrifugaat. Verzamel de waterige fase en precipiteer deze vervolgens met honderd procent ethanol en zout. Dit is een mogelijk stopmoment.

RNA kan worden bewaard bij min 80 graden Celsius tot het moment dat het monster klaar is voor gebruik in downstream toepassingen. Nadat de eerste mRNA-verrijking is voltooid, gebruiken we de Ambien microbe enrich- en microbe express-kits volgens de instructies van de fabrikant om eventueel resterend rRNA uit ons monster te verwijderen. Om de verwijdering van eukaryotisch rRNA te faciliteren, gebruiken we de microbe enrich-kit.

Alle volumes worden bepaald aan de hand van de instructies van de fabrikant. Pipetteer voor het begin 300 µL bindingsbuffer in een buisje van 1,5 mL. Voeg vijf tot 100 µg totaal RNA toe in een maximaal volume van 30 µL en vortex.

Voeg voorzichtig twee µL capture oligo mix voor vijf µg RNA toe aan de bindingbuffer en tik zachtjes tegen de buis. Centrifugeer het mengsel kort. Denatureer het mengsel bij 70 °C gedurende 10 minuten voordat het mengsel gedurende één uur bij 37 °C wordt geïncubeerd.

Bereid tijdens deze incubatie de oligo mag-beads voor door ze één keer te wassen in nucleasevrij water en één keer in bindingsbuffer, waarbij de beads tussen de wasstappen op een magneethouder worden vastgehouden. Bewaar de beads op ijs en laat ze opwarmen tot kamertemperatuur. Verwarm vijf minuten voor gebruik de wasoplossing tot 37 °C in een warmteblok.

Voeg de RNA-capture oligo-mix toe aan de gewassen oligo-magneetbeads, meng de buis voorzichtig door te keren en centrifugeer kort. Incubeer de mix kort gedurende 15 minuten bij 37 °C. Plaats de buis in het magnetische rek en wacht ongeveer drie minuten voordat het mRNA-bevattende supernatant wordt afgezogen en overgebracht naar een opvangkolf op ijs.

Voeg vervolgens 100 µL voorverwarmde wasoplossing toe aan de gevangen kralen. Vortex de gevangen kralen voorzichtig en win het supernatant terug. Verzamel dit supernatant met mRNA in de collectiebuis op ijs.

Plaats een opvangbuis op ijs terwijl u zich voorbereidt op het verwijderen van prokaryotisch rRNA met de ambi microbe express kit, die we zullen gebruiken om residueel prokaryotisch rRNA te verwijderen. Gebruik een bioanalyzer of Experion om te controleren op rRNA-contaminatie en de kwaliteit van het mRNA. Dit is een potentieel stoppunt.

RNA kan worden bewaard bij -80 °C. Zodra het rRNA is verwijderd, gebruiken we de Ambien message AMP two bacteria kit volgens de instructies van de fabrikant om ons mRNA te amplificeren. Nu we een zuiver mRNA-monster hebben, draag ik het experiment over aan Maria, die jullie door de mRNA-amplificatie en cDNA-synthese zal leiden.

Bedankt, Hannah. Voordat we beginnen met de mRNA-amplificatie, berekenen we de volumes van elk component van de Ambien message AMP two bacteria kit mastermixen online. We beginnen met de polyadenylering van het template-RNA door maximaal 1000 nanogram totaal RNA in een steriele, RNA-vrije microcentrifugebuis te plaatsen. Gebruik 6,5 microliter monster en geen RNA-vrij water in de eerste buffer om RNA te synthetiseren via in vitro transcriptie.

Het wordt aanbevolen om een hybridisatieoven of incubator te gebruiken vanwege de uniforme temperatuur. Omdat het uiterst belangrijk is dat er geen condensatie in de buisjes ontstaat, raden wij een incubatie van 14 uur aan voor de in vitro transcriptiereactie. Om de RNA-opbrengst te maximaliseren voor de hoogste A RNA-opbrengst, dient de IBT te worden uitgevoerd in een finaal reactievolume van 40 µL; bewaar A RNA bij -80 °C in aliquoten van ongeveer 10 µL.

Zodra het RNA is geamplificeerd, is het tijd om het complementaire DNA of cDNA te synthetiseren. De Promega universal ribot Clone cDNA synthesis system kit wordt gebruikt om cDNA te synthetiseren vanuit het RNA. De kit bevat instructies voor het omzetten van 2 µg RNA naar cDNA. Wij bevelen een input van 6 tot 10 µg RNA aan en het dienovereenkomstig schalen van de reacties.

Reinig het cDNA met behulp van ethanolprecipitatie of het Promega Wizard DNA Cleanup-systeem. Bewaar de monsters volgens de instructies van de fabrikant bij -80 °C. Dubbelstrengs cDNA kan op dit punt direct worden gesequenced. Uit 10 L zeewater hebben we ongeveer 10 µg milieu-RNA geëxtraheerd en 20-voudig geamplificeerd; door conversie van het geamplificeerde mRNA naar dubbelstrengs cDNA werden voldoende hoeveelheden materiaal gegenereerd voor sequencing en analyse van milieutranscripten. We hebben zojuist laten zien hoe genexpressie van mariene microbiële gemeenschappen kan worden beoordeeld met behulp van milieu-metatranscriptomics.

Houd er bij het uitvoeren van deze procedure altijd rekening mee dat mRNA snel degradeert en RNA alomtegenwoordig is. Neem daarom de standaard voorzorgsmaatregelen voor het werken in een RNase-vrije omgeving en verwerk de monsters zo snel mogelijk. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.