Micro-injectie van mRNA en morfolino antisense oligonucleotiden in zebravis embryo's.

Deze procedure begint met het voorbereiden van morpholino en in vitro getranscribeerd cap-mRNA. Een micropipet wordt gevuld door de morpholino-bevattende oplossing op te zuigen, waarna het injectievolume wordt gekalibreerd met behulp van een micrometer-enkelcelpodium. Daarna worden zebravissembryo's verzameld en geplaatst in een micro-injectiekamer voor micro-injecties in de dooier.

De werkende oplossing wordt in het dooiergedeelte net onder de cel geïnjecteerd en cytoplasmatische bewegingen worden gebruikt om de oplossing naar de cel voor micro-injecties te transporteren. Injecteer de oplossing in het cytoplasma van de cel na de injecties. Incubeer de embryo's bij 28,5 °C in E3-medium en beoordeel de relevante fenotypes in de daaropvolgende stadia.

Hoi, ik ben Shiloh Yuen van het laboratorium van Dr. Sasha en de afdeling Genetica van de Yale University School of Medicine. Vandaag demonstreren we een robuuste microinjectietechniek voor het uitvoeren van mRNA-overexpressie en morpholino-oligonucleotide gene knockdown-studies in zebravis. We maken in ons laboratorium gebruik van deze procedure om de rol van het ciliaire apparaat bij cysteuze nierziekten te bestuderen.

Laten we beginnen. Een krachtige methode voor het bestuderen van genfuncties is het micro-injecteren van in vitro getranscribeerd, gecapt RNA in zebravisembryo's. In deze demonstratie zullen we een EGFP-gelabeld transcript micro-injecteren en de GFP-expressie in het levende hele embryo gebruiken als zichtbare indicator voor een succesvolle injectie.

Eerst voeren we een in vitro transcriptie-reactie van gecapte RNA uit op het transcript van belang. In ons laboratorium voegen we routinematig het gewenste cDNA in een pCS2+ vector in en voeren we een in vitro synthese-reactie uit van grote hoeveelheden gecapt RNA met behulp van de mMessage mMachine SP6-kit. Vervolgens zuiveren we de RNA-monsters door deze te verwerken met de RNeasy Mini Kit of via fenol-chloroformextractie en isopropanolprecipitatie.

Bepaal zorgvuldig de concentratie van de RNA-preparatie en bewaar deze bij -80 °C tot het moment van gebruik op de dag van de injectie. Ontdooi de RNA-monsters, vortex deze lichtjes en centrifugeer ze kort. Bereid nu een werkoplossing met steriel water en een eindconcentratie van 0,025 tot 0,05% fenolrood; fenolrood dient als zichtbare marker voor de injectie van de oplossing in het embryo.

Hier bereiden we een werkoplossing van 100 nanogram per microliter EGFP mRNA met 0,05% fenolrood. Bewaar tot slot de werkmonsters op ijs en plaats de RNA-voorraad terug bij minus 80 graden Celsius. Ga over tot de voorbereiding van de morpho wanneer u klaar bent om dit monster te injecteren.

Morino antisense-oligonucleotiden worden op grote schaal gebruikt om genexpressie te modificeren door de translatie van een doeleiwit te blokkeren of door pre-mRNA-splicing te modificeren. Morpholino's in de zebravis dienen als een krachtig instrument voor reverse genetica door genfuncties uit te schakelen. Hier zullen we een morph-oligo micro-injecteren die gericht is op de translationele initiatieplaats van pkd2. Wij gebruiken routinematig 300 M van een morph-oligo, specifiek ontworpen voor een gen van belang, verkregen van Gene Tools LLC.

We voegen vervolgens 100 µL steriel water toe om een 3 mM voorraadoplossing te maken, waarna we de oplossing in aliquoten verdelen en bewaren bij -20 °C tot het moment van gebruik op de dag van de injectie. We verwarmen de morino-oplossing vijf minuten lang bij 65 °C. Daarna koelen we de oplossing onmiddellijk snel af op ijs en centrifugeren we deze kort; deze stap denatureert eventuele secundaire structuren in het oligo en zorgt ervoor dat de oplossing volledig is opgelost.

Vervolgens bereiden we een werkopleossing door de Morpho-oplossing te verdunnen in steriel water tot een eindconcentratie van 0,025 tot 0,05% fenolrood. In deze demonstratie bereiden we een werkopleossing van 0,5 millimolair PKD two morino met 0,05% fenolrood. Bewaar de werkopleossing bij kamertemperatuur en ga over tot het vullen van de micropipet wanneer u klaar bent om deze sample te injecteren.

Om te beginnen moeten we micropipetten maken voor de injecties. Dit gebeurt door BOS-silicaatglaskapillairen te verhitten en uit te trekken in een micropipetten-trekapparaat. Zodra de naalden zijn getrokken, worden ze bewaard in een petrischaal op een kleine hoeveelheid klei of plakband.

Vervolgens bereiden we microinjectiekamerplaten door 1,5% agarose in drie XE-mediumplaten te gieten die zijn gevormd met wigvormige geulen. Dit dient als een eenvoudige methode om de embryo's vast te houden tijdens de injectie. De agarosekamerplaten worden vervolgensstrakgelaten en bewaard bij vier graden Celsius tot ze klaar zijn voor gebruik.

Om de micropipet te beginnen te vullen, snijdt u de distale tip af met een pincet of een chirurgisch scheermesje om een opening te creëren die net zichtbaar is onder een dissectiemicroscoop bij een vergroting van 50 x. Plaats vervolgens twee µL van uw werkoplosser.

Plaats een druppel op een dekglas en bevestig de achterkant van een micropipet aan een spuit van vijf milliliter, voorzien van slang en een hypodermische naald. Dompel de distale tip van de micropipet lichtjes onder in de druppel werkoplossing. Let erop dat de tip van de micropipet niet breekt. Sifon de werkoplossing via het distale uiteinde van de micropipet door aan de zuiger van de spuit te trekken.

Vervolgens kalibreren we het injectievolume van de micropipet. Plaats een druppel minerale olie op een micrometerdiafragma en schakel de stroom- en luchttoevoer van het drukpuls-microinjectieapparaat in. Bevestig daarna de micropipet aan de micropipethouder van het microinjectieapparaat.

De micro-injector is drukgecontroleerd en de afgiften worden geactiveerd door op het voetpedaal onder de dissectiemicroscoop te drukken. Test het injectievolume door met de micro-injector een druppel van uw werkopleossing op de micrometerolie te plaatsen. Meet de diameter van de druppel terwijl deze als een bol bovenop de olie drijft.

Pas de duur en de druk van de injectie aan om het injectievolume zorgvuldig te kalibreren. Deze stap draagt bij aan de reproduceerbaarheid van het micro-injectieexperiment. In deze demonstratie worden alle micro-injecties uitgevoerd met een druppeldiameter van 0,15 millimeter.

Ten slotte, zodra het injectievolume is gekalibreerd, gebruikt u de hold-knop op de micro-injector om terugvullen en lekken van de micropipet te voorkomen. Nu is het tijd om de zebravisembryo's voor te bereiden. Zebravissen paren willekeurig; verzamel in de eerste paar uur van elke ochtend om met de voorbereiding te beginnen embryo's in het eencellige stadium en plaats deze in one XE three medium.

Plaats de embryo's met een transferpipet van drie milliliter in de wigvormige geulen van de micro-injectieplaten. Verwijder het medium zodat de embryo's ondiep ondergedompeld zijn en niet overstroomd raken. Deze stap helpt om de embryo's naar de bodem van de geulen te laten zakken en vergemakkelijkt de penetratie van het chorion door de micropipet.

Nu beginnen we met de injecties. Eerst manipuleren we de embryo's met de micropipet zodat het cytoplasma van het embryo in het eencellige stadium zichtbaar is onder de dissectiemicroscoop. Let erop dat u de punt van de micropipet niet breekt; penetreer het chorion en vervolgens de dooier met de micropipet om in het embryo te injecteren.

In deze demonstratie zullen we eerst micro-injecteren in de dooier direct onder de cel en de cytoplasmatische diffusie gebruiken om de werkopleossing in de cel te brengen. Deze stroom is zichtbaar dankzij het fenolrood dat aan de werkopleossing is toegevoegd. Aangezien dit een embryo uit één enkele cel is, kan de injectie handmatig of met een manipulator worden uitgevoerd.

We zullen ook directe injectie in het cytoplasma van de cel demonstreren. Directe micro-injectie in de cel is robuuster, maar tijdrovender omdat een correcte oriëntatie van het embryo en een specifieke micro-injectietechniek vereist zijn. Omdat het celmembraan rigider is dan het dooimembraan, is het vaak sneller om met de micropipet via het eigeel de cel te bereiken.

Het positioneren van het cytoplasma zodanig dat de dierpool naar de bodem van het gootje is gericht en het werken met een vaste hand kunnen helpen bij deze injectiemethode. Plaats de embryo's na microinjectie in een Petrischaal met E three-medium en incubeer ze bij 28,5 °C voor een normale ontwikkeling. Observeer de embryo's gedurende de volgende uren en dagen van de embryo-ontwikkeling op de fenotypes waarin u geïnteresseerd bent.

Om het succes van de micro-injectie te verifiëren, zullen we de expressie van GFP in de ontwikkelende embryo's monitoren vanaf het schildstadium via in vivo fluorescentiemicroscopie van het gehele embryo; de expressie van het construct is het sterkst tijdens de vroege gebeurtenissen van de embryonale ontwikkeling en zal vaak afnemen tijdens de ontwikkeling, naarmate het geïnjecteerde gecapte RNA geleidelijk wordt afgebroken, afhankelijk van de stabiliteit van het tot expressie gebrachte eiwit. Op basis van eerder gepubliceerde resultaten verwachten we dat het PKD2-morfino de kromming van de dorsale lichaamsas nabootst, zoals gevonden in PKD2-mutante zebravisjes, en niervormige cysten vertoont op ongeveer twee tot drie dagen na bevruchting.

We hebben u zojuist een robuuste micro-injectietechniek getoond voor het uitvoeren van mRNA-overexpressie en morpholino-oligonucleotide gene knockdown-studies in zebravis. Onthoud bij het uitvoeren van deze procedure dat het belangrijk is om met een vaste hand te injecteren. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.