Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur over Solid Media

Om de levensduur in C. elegans te meten, wordt een leeftijdgesynchroniseerde populatie gegenereerd door middel van een tijdgebonden ei-legging. Actieve volwassen hermafrodiete wormen worden overgebracht naar nematode growth media (NGM)-platen gezaaid met UV-gedode E. coli, waarbij ze zes tot acht uur lang eieren mogen leggen waarna ze worden verwijderd. Gedurende de volgende twee dagen komen de wormen uit deze eieren en groeien ze naar het L4-larvale stadium. De L4-wormen worden overgebracht naar nieuwe NGM-platen die ampicilline bevatten om levende bacteriële contaminatie te voorkomen en FUDR om reproductie te voorkomen, waarna ze zich mogen ontwikkelen tot volwassenen.

Vanaf dit punt worden de volwassen wormen elke twee tot drie dagen geobserveerd totdat alle wormen zijn gestorven. Op elk tijdstip worden de dode wormen van de plaat verwijderd en wordt het aantal levende en dode wormen geregistreerd. Ik ben George Seton van het laboratorium van Matt Capline van de afdeling Pathologie aan de University of Washington.

Vandaag laten we u zien hoe u de levensduur meet en kijken we naar onze hepatitis elegance. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de genetica van veroudering te bestuderen. Laten we beginnen.

Een basisexperiment naar de levensduur vereist twee soorten platen: standaard NGM-platen, die geen additieven bevatten, en AMP FUDR-platen, waaraan zowel ampicilline als fluorodeoxyuridine aan de NGM zijn toegevoegd. Beide soorten platen worden bezaaid met e coli OP 50-bacteriën, die vervolgens worden gedood door blootstelling aan uv. Begin met het bereiden van 10 milliliters NGM-oplossing.

Smelt voor elke Petri-schaal van 60 millimeter vaste NGM volledig door deze in pulsen van 32 seconden op hoge stand in de magnetron te verhitten. Draai het medium tussen de pulsen door om te voorkomen dat er onder druk staande gasbellen ontstaan; plaats de vloeibare NGM in een waterbad van 55 graden Celsius of op de werkbank om het medium af te koelen. Zodra het medium is afgekoeld tot 55 graden Celsius, op welk punt u de glazen container comfortabel met blote handen zou moeten kunnen vasthouden, is het gereed voor de toevoeging van geneesmiddelen.

Om de platen met geneesmiddelen te gieten, voegt u 33 µL van 150 mM FUDR en 100 µL van 100 mg/mL ampicilline per 100 mL NGM toe en draait u de plaat rond om te mengen. Ampicilline wordt gebruikt om vreemde bacteriële contaminatie te voorkomen en FUDR om te voorkomen dat eieren uitkomen. Zo hoeven de wormen niet elke paar dagen te worden overgezet om ze te scheiden van groeiende larven.

Giet nu het medium en laat de platen twee dagen op de werkbank drogen. Op de dag voordat de platen klaar zijn met drogen, wordt een vloeibare LB-cultuur geënt met een enkele kolonie van een verse uitstrijk van E. coli OP 50 bacteriën op LB-agar. Bereid ten minste 0,5 milliliter cultuur per 60 millimeter plaat voor.

Plaats de OP 50-cultuur in een schudincubator op 37 °C en laat de bacteriën een nacht groeien. Pellet de volgende dag de OP 50-bacteriën met een centrifugale kracht van 3 500 g gedurende 10 minuten. Decanteer voldoende supernatant om de bacteriën te resuspenderen tot een 10 x concentratie.

Inoculeer nu elke plaat met 100 µL van de geconcentreerde cultuur. Vermijd contact tussen de pipetpunt en het oppervlak van de NGM, aangezien beschadigingen in het oppervlak van het medium de wormen in staat stellen om in het medium te graven; draai de platen rond totdat de bacteriën het centrale gebied van de NGM bedekken zonder de wanden van de plaat te raken, en laat de platen 24 uur drogen op de werkbank. Wanneer ze droog zijn, wordt het oppervlak van de platen blootgesteld aan een UV-dosis die sterk genoeg is om de bacteriële groei te stoppen; wij gebruiken een StrataGene UV Crosslinker 2400.

Begin met het plaatsen van de platen in de straddle linker zonder hun deksels. Druk nu op energy. Voer 9 9 9 9 in op het toetsenbord en druk op start.

De platen worden gedurende ongeveer vijf minuten blootgesteld aan UV-licht. Platen met UV-gedode bacteriën kunnen ondersteboven worden bewaard bij vier graden Celsius voor maximaal een maand. Deze sectie beschrijft hoe men een populatie wormen met een gemeenschappelijke uitkomstdatum kan genereren.

Begin met het overbrengen van ongeveer 20 jonge volwassen wormen naar een verse NGM-plaat zonder geneesmiddelen. Laat de plaat ongeveer een week op 25 °C staan, zodat de wormen zich kunnen voortplanten en al het bacteriële voedsel binnen een week consumeren. Zodra er pas uitgekomen wormen in het groeistop-dauerstadium verschijnen, moeten 20 tot 30 dauerlarven worden overgebracht naar een verse NGM-plaat zonder geneesmiddelen en bij 25 °C worden geïncubeerd in aanwezigheid van voedsel.

De dower-larven worden binnen twee dagen reproductief actieve volwassenen en blijven daarna nog enkele dagen reproductief actief. Draag nu 10 tot 15 van de reproductief actieve volwassenen over naar een verse NGM-plaat zonder geneesmiddelen. Deze plaat wordt aangeduid als de timed egg laying- of TEL-plaat.

Laat de TEL-plaat bij 25 °C zodat de wormen eieren kunnen leggen. De dieren die uit deze eieren uitkomen, zullen de experimentele dieren zijn en hun levensduur wordt na zes uur gescoord. Inspecteer de TEL-plaat op eieren.

Als er nog niet genoeg eitjes zijn, laat de TEL-plaat dan tot een totaal van 24 uur bij 25 °C staan. Controleer periodiek op de aanwezigheid van eitjes. Wanneer er een voldoende aantal eitjes is gelegd, worden de volwassen dieren van de TEL-plaat verwijderd.

Voor een typisch experiment naar de levensduur zijn 30 tot 90 eieren per experimentele groep nodig, maar op een enkele TEL-plaat kunnen enkele honderden eieren worden gegenereerd. Ongeveer 150 eieren worden in zes tot acht uur gelegd door 10 tot 15 reproductief actieve volwassenen. Bij het vergelijken van experimentele groepen kan statistische significantie worden bereikt voor grote verschillen in levensduur met slechts 30 dieren.

Er moeten meer dieren worden gebruikt om bescheiden verschillen te kunnen onderscheiden. Plaats de TEL-plaat zonder volwassen dieren nu bij 20 °C totdat de eieren zijn uitgekomen en de wormen zich hebben ontwikkeld tot het L4-larvale stadium. Dit duurt gewoonlijk twee dagen voor wild-type C. elegans, maar kan langer duren voor stammen met fenotypes die een trage ontwikkeling vertonen.

Deze sectie beschrijft hoe het leven van een leeftijdgesynchroniseerde populatie kan worden gevolgd. Draag eerst de L4-larven over van de TEL-plaat naar geplaatste AMP FUDR-platen. Voor elke stam of conditie die wordt getest, is het gebruikelijk om twee tot drie platen in te richten met 25 tot 30 wormen per plaat.

Incubeer de AMP FUDR-platen gedurende 24 uur bij 20 °C. Beoordeel vervolgens visueel de wormen, het medium en de bacteriën, en breng de wormen over naar verse AMP FUDR-platen. Dit gebeurt doorgaans één of twee keer per week, indien de wormen het grootste deel van het bacteriële voedsel hebben geconsumeerd.

Als er vroeg in het experiment een aanzienlijk aantal larven aanwezig is, duidt dit gewoonlijk erop dat de wormen als jonge volwassenen in plaats van als L4-stadia op de AMP FUDR-platen zijn overgebracht. Jonge volwassenen kunnen eieren leggen voordat FUDR effect heeft, en af en toe ontsnappen larven aan de effecten van FUDR en groeien ze uit tot volwassenen. Deze larven zullen het experiment beïnvloeden; breng in deze situatie de volwassen wormen over naar verse platen en gooi de oude platen die de larven bevatten weg.

Wormen moeten ook worden overgebracht naar verse plaatjes als er levende, groeiende bacteriën worden waargenomen. Over het algemeen zorgt de combinatie van AMP en UV-bestraling ervoor dat er geen levende bacteriën het experiment contamineren, maar af en toe komt dit voor. Breng in dat geval de wormen over.

Indien er schimmelgroei op het medium wordt waargenomen. Als dit vroeg genoeg wordt opgemerkt, kan de schimmel worden verwijderd met behulp van een pipetpunt of spatel. Zodra de schimmel een diameter van meer dan enkele millimeters bereikt, is het meestal eenvoudiger om de wormen over te brengen naar een nieuwe plaat.

Beoordeel elke twee tot drie dagen de levensduur van alle wormen. Gebruik hiervoor een dissectiemicroscoop. Bepaal of elke worm levend of dood is.

Tik voorzichtig tegen de plaat. De worm is in leven als deze beweegt als reactie op het tikken. Als de worm niet reageert op het tikken tegen de plaat, zoom dan in op de kopregio en tik voorzichtig tegen de kop van de worm met een platinatransfernaald.

Markeer de worm als dood. Als deze niet reageert door met de kop te bewegen, verwijder dan de dode worm van de plaat. Noteer na het controleren van alle wormen de datum en het aantal levende en dode wormen.

Wormen die op vaste media worden gehouden, ontsnappen af en toe van het platoppervlak door te graven of tegen de wand omhoog te kruipen. Wormen die ontsnappen, worden volledig uitgesloten van de studie. Plaats de platen na afloop terug in de incubator van 20 °C.

Wacht nog twee tot drie dagen en controleer vervolgens de platen opnieuw. Zet dit regime voort totdat elke worm is gestorven. Het aantal wormen dat per dag sterft, wordt gewoonlijk geïnverteerd om de proportie levende wormen per dag te berekenen; deze gegevens worden grafisch uitgezet als een overlevingscurve, waarbij de dag van de getimede eiafzetting in rekening wordt gebracht.

Dag nul. De typische mediane levensduur van *C. elegans* wildtype-stammen, gekweekt op UV-gedode bacteriën bij 20 graden Celsius, bedraagt ongeveer 25 dagen, gemeten vanaf het eistadium.

We hebben zojuist aangetoond hoe u de levensduur kunt meten en elegantie kunt waarnemen. U kunt deze basisprocedure aanpassen om verschillende omgevingscondities te testen, waaronder dieetrestrictie en RNA-interferentie, wat wordt besproken in de begeleidende tekst. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.