Focus Ca ^{2 +} Voorbijgaande Detectie in glad spierweefsel

Eerst wordt een calciumlaadoplossing bereid, opgewarmd en belucht. De urinablaas wordt gedissecteerd, geopend, platgepind en er wordt een strook detrusor afgenomen. De detrusorstrook wordt toegevoegd aan de laadoplossing, geïncubeerd, gespoeld en platgepind.

De calciumfluor binnen het weefsel wordt geëxciteerd door laserlicht en het geëmitteerde licht wordt vastgelegd. Films bestaande uit individuele frames worden geanalyseerd door opeenvolgende frames met elkaar te vergelijken. De achtergrond wordt afgetrokken.

De drempelwaarde voor de celrand bepaalt waar events kunnen worden gevonden en er wordt een ratio tussen opeenvolgende hersenen berekend. Als de resterende events voldoen aan vooraf gedefinieerde criteria, worden ze gemarkeerd en gelabeld. Hallo, mijn naam is John Young van de laboratoria van Keith Brain en Tom Kinane op de afdeling Farmacologie van de universiteit van Oxford.

Ik ben Rob Amos, evenals Keith Brain, beiden van de Brain- en Canne-labs. Vandaag zullen John en Rob u een calcium-imagingtechniek in glad spierweefsel laten zien. We gebruiken dit in ons laboratorium om de afgifte van neurotransmitters uit autonome zenuwen en het effect daarvan op glad spierweefsel te bestuderen.

Laten we beginnen. De calciumindicator Organ Green 488 BAPTA-1 wordt geleverd in vials van 500 µL die 50 µg poeder bevatten. Om de calciumindicator te bereiden, voegt u 40 µL ONIC F1 27-oplossing toe aan het poeder en schudt u dit gedurende 30 seconden voorzichtig. Voeg daarna 460 µL fysiologische zoutoplossing (PSS) toe en schud nogmaals 30 seconden voorzichtig.

De uiteindelijke oplossing, 10 µM Organ Green 488 BAFTA, levert vier aliquots van elk 125 µL op. Vermijd blootstelling aan licht en bewaar de oplossing bij -20 °C voorafgaand aan het dissekeren van het betreffende weefsel.

Haal de calciumindicator uit de vriezer en laat deze ontdooien bij kamertemperatuur terwijl de calciumindicator ontdooit. Plaats één milliliter PSS in een reageerbuis en in een waterbad op 33 °C. Bevestig een borstelaar in de reageerbuis met een stop, of u kunt ook Parafilm gebruiken, en borrel vervolgens met een mengsel van 95% oxygen en 5% carbon dioxide met een snelheid van ongeveer één bel per seconde.

Dissekeer het gladspierorgaan uit het dier. In dit geval betreft dit de urineblaas van een muis. Plaats het orgaan in ongeveer 50 millimeter PSS om het te wassen; nadat het weefsel zorgvuldig is gewassen, verwijdert u het omliggende vetweefsel en bindweefsel.

Dissekeer de urineblaas open volgens het laurean-type voor glad spierweefsel. Open deze longitudinaal vanaf de blaas hals, het caudale uiteinde, tot aan de top van de koepel. Bereid aan het craniale uiteinde vier stroken voor, zes tot acht millimeter lang en één tot twee millimeter breed, langs het dorsale oppervlak van de resser, waarbij wordt gesneden in de richting van de dominante spierbundels.

Plaats het gedissecteerde weefsel en de voorverwarmde en gebubbelde PSS om de calciumindicator te laden met 125 µL van 10 µM organ green 488B in de reageerbuis bij het weefsel en schud deze voorzichtig met de hand om te mengen. Plaats de buis terug in het waterbad. Hervat het bubbelen en dek het waterbad af met een vel folie.

De tijd die nodig is voordat voldoende weefsel de calciumindicator heeft opgenomen, varieert afhankelijk van de grootte van het weefsel en de dikte van de gladde spierlaag. Zo is dit voor de detrusormspier van de muis en de oxs van de rat 70 minuten. Voor de detrusormspier van de rat en de VAs deens van de muis incuberen we gedurende 120 minuten.

Zodra het weefsel is geladen met de calciumindicator, kan het worden voorbereid voor microscopie. Spoel het weefsel eerst gedurende 10 minuten in gebubbelde PSS. Monteer het weefsel vervolgens in een preparatieschaal met een S-guard.

Rek het weefsel lichtjes uit om een plat vlak te vormen. Zet het weefsel vast met korte stukjes, bijvoorbeeld zilverdraad van 2 millimeter lang met een diameter van 25 tot 50 micrometer, en steek de pinnen onder een hoek in.

Vermijd het gebruik van spelden die langer zijn dan enkele millimeters, aangezien deze het objectief kunnen bekrassen. Zorgvuldig vastpinnen van het weefsel is belangrijk om spontane contractie van het weefsel te minimaliseren en om het lokaliseren van een geschikte plek voor beeldvorming te vergemakkelijken. Plaats de preparatieschaal op de objecttafel van de microscoop nadat het weefsel is vastgepind.

Zorg ervoor dat de PSS niet buiten het gebied van de schaal dat met sil-guard is bekleed stroomt. Dit kan er namelijk toe leiden dat een groot oppervlak met PSS wordt bedekt. Wanneer de superfusie voor demonstratiedoeleinden begint, worden de volgende stappen in het licht uitgevoerd.

Let op: deze experimenten worden normaal gesproken in het donker uitgevoerd. Schakel de pomp in om de preparatie te superfuseren. Bij PSS wordt vaak een snelheid van 100 milliliters per uur gebruikt.

Zet de verwarmingsunit aan, plaats de in- en uitstroombuizen en de temperatuurprobe op de preparatieschaal en bevestig deze elk aan de metalen strip met de magneet aan de basis. De hoogte van de tip van de uitstroombuis bepaalt de diepte van de PSS. Let erop dat de uitstroom daadwerkelijk PSS verwijdert, aangezien dit soms niet gebeurt.

Stel de temperatuur van de verwarmingseenheid aanvankelijk zo in dat de gewenste temperatuur tussen 33 en 35 °C wordt bereikt. Laat het weefsel gedurende ten minste 10 minuten equilibreren met een objectief met lage vergroting (10x of 20x).

Gebruik epi-fluorescentie of excitatie met blauw licht om de gladde spier te bekijken en identificeer een geschikt gebied om te monitoren. Omdat blootstelling aan excitatieverlichting de indicator zal doen fotobleken, moet dit niet langer dan enkele seconden per keer worden gebruikt.

Vermijd gebieden met heldere structuren, omdat deze een groot aantal fout-positieven in het beelddetectie-algoritme kunnen veroorzaken. Probeer een locatie te kiezen met minimale beweging en een groot aantal gladde spiercellen in het gezichtsveld. Zodra u de locatie voor beeldvorming heeft geselecteerd, schakelt u over naar een objectief met een hogere vergroting, zoals 40 x.

Draai de tafel of de optische as zodat de gladdecelsnelheidscel of -cellen horizontaal liggen. Dit is parallel aan de snelle scan-as. De gladdecelsnelheidscellen zijn nu klaar voor beeldvorming via confocale microscopie.

In dit protocol gebruiken we een Leica SP two rechtopstaande confocale microscoop. Sluit het pinhole tot één airy disc. Stel de lasersterkte in tussen 25 en 35% op het custo optic instelbare filter.

Deze waarde is een compromis tussen helderheid en fotobleken. Download en installeer ImageJ ter voorbereiding op de data-analyse. Download de platformspecifieke versie en update deze vervolgens naar de nieuwste versie door het nieuwste ImageJ jar-bestand te downloaden om het oude bestand te vervangen. Download daarna het Excel writer jar-bestand en installeer dit in de plugins jar-directory.

Kopieer deze bestanden naar de plugins-map. Installeer elk van deze scripts met behulp van de plugins-macro's. Installeer de functie van ImageJ. De software voor de Leica SP2-confocale microscoop die wij gebruiken heet Leica.

LCS slaat individuele frames van elke serie op als een apart bestand. Om de serie te reconstrueren, moet u ervoor zorgen dat alle te reconstrueren frames in één enkele map staan.

Bijvoorbeeld, de tiffs-map met gegevens. Selecteer vervolgens de Leica SP two stacker-macro uit het menu plugins macros. Selecteer de rootdirectory, in dit geval de gegevensmap.

Selecteer de gewenste map uit de vervolgkeuzelijst. Kies in dit geval een uitvoermap voor tiffs of maak een nieuwe map aan. Bijvoorbeeld, data folder stacks.

Het script zal vervolgens series reconstrueren uit individuele frames om bewegingsartefacten te corrigeren. We maken gebruik van een vrij beschikbaar algoritme dat frames binnen een series-downloadsstack uitlijnt of koppelt, namelijk rig en turbo reg. Kopieer de bestanden voor beide naar de map stacks.

Laad een stack die verwerkt moet worden en ga vervolgens naar een frame waarop het interessegebied duidelijk zichtbaar is. Andere frames zullen worden uitgelijnd op dit referentiekader. Ga daarna naar plugins stacks.

Stack Reg. Probeer elk van de verschillende transformaties om te bepalen wat het meest effectief is voor elke locatie. Beeldeffecten die de detectie van calciumtransiënten beïnvloeden, zullen variëren door bepaalde eigenschappen en partikelparameters van elke locatie te meten.

De gevoeligheid en specificiteit van de detectie worden verhoogd. Daarom berekenen we voor elke locatie de drempelwaarde voor de afgetrokken drempelwaarde voor de ratio en de drempelwaarde voor de celrand. Ga eerst naar plugins, macros, install en selecteer jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. Ga vervolgens naar plugins macros load stack.

Selecteer een reeks en bereken de volgende partikelparameters. Om de drempelwaarde voor aftrekking te berekenen, selecteert u een rechthoekig interessegebied over wat u beschouwt als de achtergrondmeting. Noteer het gemiddelde. Om de drempelwaarde voor de ratio te berekenen, selecteert u een rechthoekig interessegebied rond een optisch vlak gebied van de gladdespiercel of -cellen.

Meet de waarden en noteer het gemiddelde en de standaarddeviatie. Herhaal dit proces nog twee keer, of u kunt drie selectievakken tegelijk trekken door op shift te drukken. Bereken en noteer de drempelwaarde voor de ratio.

Bereken dit als de standaarddeviatie gedeeld door het gemiddelde plus één, en vermenigvuldig vervolgens het resultaat met 32. Bij het middelen van waarden van de drie replica's is de factor 32 noodzakelijk om rekening te houden met het ratio-algoritme, waarbij geen verandering ten opzichte van het voorgaande frame wordt toegewezen aan een gehele waarde van 32. Dit biedt een goed dynamisch bereik om toenames en afnames in de ratio te detecteren.

Selecteer voor een 8-bit afbeelding de optie drempelwaarde aanpassen (image adjust threshold). Kies voor zwart-wit. Definieer de bovenste schuifregelaar en noteer de bijbehorende waarde.

Dit bevindt zich rechts van de schuifregelaar. Alleen gebeurtenissen die in de zwarte gebieden plaatsvinden, worden geteld. Klik op reset.

Nu de drempelwaarde voor de afgetrokken ratio en de drempelwaarde voor de celrand zijn berekend, kunnen we de beeldstacks analyseren. Bepaal de locatie van de te analyseren stacks. Selecteer in deze fase slechts één serie.

Dit is het eerste bestand, en het laatste bestand moet gelijk zijn. Selecteer vervolgens een locatie voor de output van de databestanden en stacks. Bijvoorbeeld, de map voor data-output.

Voer de waarden in voor de drempelwaarde voor aftrekking, de drempelwaarde voor de ratio en de drempelwaarde voor de celrand. Laat de overige instellingen op hun standaardwaarden staan. Het algoritme genereert een venster met twee panelen, waarin de bewerkte reeks links en het origineel rechts wordt getoond.

Open dit bestand vanuit de outputmap en loop hier zorgvuldig doorheen om het aantal fout-positieven en de gevallen waarin met het blote oog zichtbare gebeurtenissen niet zijn gedetecteerd, te beoordelen. Voor elke serie genereert het algoritme een Excel-bestand waarin kenmerken van de gedetecteerde gebeurtenis worden gespecificeerd, zoals amplitude, oppervlakte en positie. Fout-positieven die zijn geïdentificeerd door de door het algoritme gegenereerde afbeeldingsbestanden te beoordelen, kunnen handmatig uit dit Excel-bestand worden verwijderd. Hiervoor dient u echter strikte criteria te hanteren.

Dit is een film van calciumtransiënten in glad spierweefsel. In dit voorbeeld bestaat de film uit 100 individuele frames die met een frequentie van vijf hertz zijn opgenomen. We zouden veel van dit soort films per experiment opnemen wanneer we bijvoorbeeld het effect van een specifiek geneesmiddel op de frequentie van de calciumtransiënt onderzoeken.

Hier zien we talrijke spontane calciumtransiënten in de gladde spiercellen. Het resultaat van het algoritme voor deeltjesdetectie wordt hier getoond. Voor elke serie genereert het algoritme een Excel-bestand waarin kenmerken van het gedetecteerde event worden gespecificeerd, zoals amplitude, oppervlakte en positie.

We hebben een methode gedemonstreerd voor het in beeld brengen van calciumtransiënten in gladde spierorganen, zoals de urineblaas, en we hebben een manier laten zien om deze calciumtransiënten te analyseren met behulp van een algoritme dat we in het lab hebben ontwikkeld. Het is belangrijk om te onthouden dat het weefsel zorgvuldig moet worden voorbereid voor de calciumimaging. In het geval van het weefsel dat we vandaag hebben gedemonstreerd, houdt dit in dat bindweefsel en eventueel vet dat het gezichtsveld kan belemmeren, worden verwijderd.

Het is daarnaast belangrijk om het weefsel als een platte laag vast te pinnen. Nou, veel succes met uw experimenten en bedankt voor het kijken.