Batch Immunokleuring Grootschalige eiwitdetectie in de Whole Brain Monkey

Deze procedure begint bij ontvangst van een met 4% PFA geperfuseerd, geëxtraheerd en cryoprotectief behandeld brein, dat naar Neuroscience associates is verzonden voor inbedding met behulp van uitlijningspunten in de omringende matrix. Met behulp van gespecialiseerde mandjes en containers kan het brein in het coronale vlak worden gesneden om seriële coupes van een gewenste dikte te produceren, die de volledige anterieur-posterieure omvang van het brein vertegenwoordigen. Batch-immunoprocessing kan worden uitgevoerd om het ruimtelijke expressiepatroon van een eiwit in het gehele brein te bepalen.

Hallo, ik ben Dr. Shaheen Zur van het Visual Neurosciences Laboratory aan de School of Optometry van de Universiteit van Montreal. Hallo, ik ben Dr. Mark Burke, ook van het Visual Neurosciences Laboratory aan de School of Optometry van de Universiteit van Montreal. Hallo, ik ben Dr. Mo Petto, directeur van het Visual Neuroscience Laboratory aan de School of Optometry van de Universiteit van Montreal.

Vandaag tonen we u een procedure voor batch-immunokleuring voor grootschalige proteïnedetectie in een volledige apenhersenen. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de expressiepatronen van doeleiwitten in de gehele hersenen te bestuderen en om de expressie van deze eiwitten binnen dezelfde hersenen te vergelijken en te contrasteren. Laten we beginnen.

Verkrijg voorafgaand aan de histologische verwerking een primaatbrein dat is geconserveerd via systemische perfusie en post-fixatie, en cryoprotectie met behulp van oplossingen van gradueel oplopende sucroseconcentraties. In dit stadium wordt het brein naar neuroscience associates gestuurd om te worden ingebed en in vrije coupes gesneden met gebruik van hun eigen technologie. Na ontvangst zal men waarnemen dat er zeven uitlijningspunten in de inbeddingsmatrix zijn geplaatst, zodat de coupes correct kunnen worden georiënteerd en opnieuw kunnen worden uitgelijnd nadat de histologische verwerking is voltooid.

Tijdens het snijden worden digitale beelden gemaakt die later kunnen worden gebruikt voor de 3D-reconstructie van anatomische kaarten. Neurowetenschappelijke assistenten verwerken ons weefsel om seriële, 50 micrometer dikke, vrij zwevende coronale coupes van het gehele brein te verkrijgen. Zodra dit is voltooid, kunnen we beginnen met de histologische verwerking van de coupes.

Wanneer we beginnen met de histologische verwerking, hebben we doorgaans ongeveer 140 coupes per antilichaam of kleuring te verwerken. Hier demonstreren we de techniek met een kleinere set coupes die behandeld zijn met het antilichaam SMI 32, een monoklonaal antilichaam tegen niet-gefosforyleerde neurofilament-eiwitten. Gedurende de procedure worden gespecialiseerde kleurkommen en mandjes gebruikt, waardoor een groot aantal vrijdrijvende coupes gelijktijdig en efficiënt kan worden verwerkt.

Dit zorgt ervoor dat de resulterende kleuring consistent is over alle coupes. De eerste stap is het incuberen van de coupes gedurende 60 minuten in een op PBS gebaseerde oplossing die TRITTON X 100 en normaal paardenserum bevat. Dit vermindert de aspecifieke binding van antilichaamsmoleculen die leidt tot achtergrondkleuring.

Vervolgens worden de coupes een nacht geïncubeerd. De volgende dag worden de coupes drie keer gedurende 10 minuten gewassen in wasoplossing en daarna twee uur bij kamertemperatuur geïncubeerd in een op PBS gebaseerde SMI 32-antilichaamoplossing, aangevuld met Triton X 100 en normaal paardenserum, gevolgd door incubatie in een op PBS gebaseerde gebiotinyleerde Muse-secundair antilichaamoplossing die Triton X 100 en normaal paardenserum bevat.

Na een reeks van drie aanvullende wasbeurten van 10 minuten worden de coupes gedurende één uur bij kamertemperatuur geplaatst in een oplossing van avadon biotine-geconjugeerd mierikswortelperoxidasecomplex. Ten slotte worden de coupes, na nog een reeks wasbeurten, gedurende 10 minuten blootgesteld aan een D-aminobenzidine-reactie, wat een bruine kleuring produceert binnen de immunoreactieve neuronen. De reactie wordt vervolgens gestopt door de kleurmand te verwijderen en de coupes onder te dompelen in PBS.

Na twee tot drie spoelingen van vijf minuten in PBS zijn de coupes klaar om individueel op glazen objectglaasjes te worden gemonteerd; het montageproces wordt uitgevoerd met een grote Petrischaal en zeer zachte schilderspenselen. De coupes worden uit de PBS-buffercontainer getild en individueel gemonteerd op met gelatine gecoate objectglaasjes. De monsters worden vervolgens een nacht lang aan de lucht gedroogd in een zuurkast tot de volgende dag.

De coupes worden gespoeld door ze in gedeïoniseerd water te dompelen om eventuele zoutkristallen die over zijn gebleven na het inbeddingsproces af te wassen. De preparaten worden vervolgens gedehydrateerd in een reeks ethanolstappen met oplopende concentratie, gereinigd in xyleen en gedekt met Permount montage medium. In dit stadium moeten de preparaten ongeveer een week tot 10 dagen in horizontale positie worden bewaard om het montage medium te laten uitharden.

Daarna kunnen de preparaten worden bewaard in een objectglazendoos of worden onderworpen aan beeldvorming via microscopie. Deze methode levert een volledig expressieprofiel op van een doeleiwit van belang in een volledige apenhersenen. Hier tonen we representatieve coronale coupes die een momentopname geven van de expressie van FMRP, neuN en SMI 32.

In hetzelfde apenbrein. We hebben zojuist laten zien hoe u batch-immunokleuring uitvoert voor een doeleiwit in het gehele brein. Bij deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alle coupes mild worden geschud tijdens de incubatie in de verschillende oplossingen en dat ze te allen tijde volledig ondergedompeld blijven.

Neem daarnaast de tijd tijdens het maken van de preparaten en verwijder zoveel mogelijk rimpels en plooien zonder de integriteit van het weefsel aan te tasten. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.