Micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de Drosophila melanogaster Syncytieel Embryo

Deze procedure begint met het verzamelen van embryo's op verse druivensapplaten gedurende 30 tot 60 minuten. Haal de plaat uit de kooi in het meer, raap de embryo's op met een bevochtigde kwast en plaats ze op dubbelzijdige plakband. Rol één embryo voorzichtig over het plakband met één helft van een pincet totdat het chorion openscheurt.

Pak het embryo op en plaats het voorzichtig op het dekglas. Breng een laag hete lijm aan. Herhaal dit totdat u voldoende embryo's heeft.

Na dehydratie zijn de embryo's klaar voor injectie. Hallo, ik ben Ingrid Bruce Musher van het laboratorium van Dr. Jonathan Sculley van de afdeling Moleculaire en Cellulaire Biologie aan de University of California Davis. Vandaag laten we u een procedure zien voor het micro-injecteren van syncytiale embryo's van drosophila.

We gebruiken deze procedure om de rol van microtubuli en mitrale motoren tijdens de mitose te bestuderen. Zo micro-injecteren we antilichamen of andere remmers van specifieke mitotische eiwitten. Door het effect van de remmer op de mitose te analyseren, kunnen we de functie van het doeleiwit bepalen.

Laten we beginnen. Om twee tot drie dagen voor het experiment met de voorbereidingen te starten, richt u de legkooi in door twee kleine gaten van ongeveer één centimeter vierkant aan tegenovergestelde zijden van een plastic fles te snijden. Vul de gaten met een stukje watten, zodat de luchtstroom behouden blijft.

Tik de vliegen in de fles en dek deze vervolgens af met een druivensapplaat. Bewaar de kooi met gist op kamertemperatuur; de vliegen zullen tot 10 dagen eitjes leggen, minstens één dag vóór het experiment. Trek de injectienaalden klaar en bewaar deze bij vier graden Celsius.

Bereid op de dag van het experiment de naalden voor en laad deze. Haal eerst de gelabelde tubuline uit de vriezer en plaats deze gedurende vijf tot 15 minuten op ijs. Verdun het vervolgens met GPEM-buffer en centrifugeer het daarna 10 tot 15 minuten bij 13 000 RPM op vier graden Celsius.

Laad tot slot één tot twee µL in de naald en bewaar deze bij 4 °C om temperatuurgeïnduceerde polymerisatie in de naald te voorkomen. Maak voor het plaatsen van het dekglas heptaanlijm door dubbelzijdige plakband op te rollen en dit in een fles van 100 mL te plaatsen.

Voeg ongeveer 50 milliliters heptaan toe, sluit de fles af en schud deze gedurende enkele dagen. Maak, voordat de embryo's worden voorbereid, een dehydratiekamer waarin de embryo's vóór de injectie worden geplaatst. Doe dit door een deel van een 35 millimeter schaaltje in een 100 millimeter Petrischaal te plaatsen om een tafel te vormen; voeg vervolgens droogmiddel, namelijk watervrij calciumsulfaat, eromheen toe, zodat de hoogte van het droogmiddel niet hoger is dan de tafel, en dek dit af.

Om de embryo's voor te bereiden, verzamel je deze eerst uit de lake-cage door elk uur de druivensapplaat met gist te vervangen; de embryo's moeten ongeveer twee uur na het begin van de collectie worden gefotografeerd. Om het dekglas voor te bereiden, plaats je dit op één zijde van een microscoopglaasje en plak je de vier hoeken vast zodat het niet verschuift. Breng met een wattenstaafje één laag heptaanlijm in een lijn aan op het dekglas.

De lijm mag niet stroperig zijn en moet binnen enkele seconden drogen. Als deze te dik is, voeg dan meer heptaan toe. Plak tot slot een stukje dubbelzijdige plakband op de objectglas naast het dekglas.

Breng een beetje slip aan met een vochtig penseel. Pak de embryo's voorzichtig op van de druivensapplaat en plaats ze op de dubbelzijdige plakband op de objectglas. Gebruik vervolgens één zijde van een pincet om de embryo's over de dubbelzijdige plakband te rollen totdat het chorion openscheurt.

Pak het embryo op door het voorzichtig over het Corian te rollen zodat het aan de pincet hecht, en plaats het op de heptaanlijm op het dekglas. Schuif het dekglas zodanig dat de lange zijde van het embryo parallel loopt aan de lange zijde van het dekglas. Plaats 10 tot 20 embryo's in één rij.

Verwijder het dekglas en plaats het gedurende drie tot acht minuten in de dehydratiekamer. De tijd is afhankelijk van de lokale luchtvochtigheid en de hoeveelheid die geïnjecteerd moet worden. Plaats het dekglas vervolgens op een metalen kamer met vacuümvet.

Dek de embryo's ten slotte af met halocarbonolie om verdere uitdroging te voorkomen. De embryo's zijn nu klaar voor injectie. Lokaliseer eerst de embryo's onder een 16 x objectief.

Verplaats de embryo's en zoek de naald zonder het brandvlak te wijzigen. Centreer de naald en beweeg deze omhoog zonder deze in de X- of Y-richting te verplaatsen. Om de naald te openen, plaatst u de rand van het dekglas in het gezichtsveld, maar niet op de plek waar de naald zich zal bevinden.

Breng de naald vervolgens naar hetzelfde brandvlak. Verplaats het dekglas zeer voorzichtig totdat het de naald raakt en deze zachtjes openbreekt. Beweeg de naald omhoog.

Breng nu de embryo's in beeld. Laat de naald in de olie zakken en zorg ervoor dat er mooie vloeistofdruppels uit de naald komen. Beweeg het embryo gestaag naar de naald toe, injecteer een druppel in het embryo en verplaats het embryo vervolgens weg.

Nadat alle embryo's zijn geïnjecteerd, kunnen ze worden geobserveerd met een confocale microscoop met een 60x of 100x objectief. Een controle-embryo zou eruit moeten zien als het embryo in deze video. Dit is een embryo dat GFP-tubuline en RFP-histon tot expressie brengt, gefotografeerd met een 100x objectief op een spinning disc confocale microscoop.

De totale getoonde tijd is acht minuten. Grafieken van de afstand van pool tot pool zijn zeer reproduceerbaar en vormen een betrouwbare maatstaf voor succes in controle-embryo's. Deze zouden eruit moeten zien als die die hier worden getoond voor cyclus 11 tot en met 13.

In deze film wordt een ander controle-embryo getoond. Dit embryo tot overexpressie van KLP 61 FGFP en is geïnjecteerd met r Domine tubuline. Ook dit is gefotografeerd met een 100 x objectief op een spinning disc confocale microscoop, en de totale tijdsduur is zeven minuten.

Deze film is onmiddellijk na micro-injectie opgenomen, en de gradiënt in de concentratie van r Domine tubuline is duidelijk zichtbaar aan het begin van de film. Deze embryo's kunnen worden gebruikt om de inhibitie van Klp 61 F te bestuderen na micro-injectie van Klp 61 F-antilichamen. We kunnen het verlies van Klp 61 FGFP uit de spoelen zien.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u micro-injecties uitvoert in drosophilas incisional embryo's. Bij deze procedure is het belangrijk om controles uit te voeren; oefen eerst met het injecteren van alleen buffer of rutin, en controleer of de mitose normaal verloopt tijdens de cellulaire fase. Zodra al uw injecties betrouwbaar zijn en geen schade veroorzaken, kunt u een inhibitor injecteren en het effect van die specifieke inhibitie bestuderen.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.