Het genereren van Chimère zebravis embryo's door transplantatie

Hoi, ik ben Hillary Kemp van het laboratorium van Cecilia Owens. En ik ben Cecilia Owens. Hillary en ik zijn werkzaam bij de afdeling basiswetenschappen van het Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle.

Vandaag laten we u een techniek zien voor het maken van chimere zebravissenembryo's, ook wel bekend als genetische mozaïeken. Deze procedure stelt ons in staat om de cellulaire basis van genfunctie tijdens de ontwikkeling te beoordelen. We kunnen onderzoeken of een bepaald gen functioneert binnen de cellen met een mutant fenotype, wat bekend staat als celautonome functie, of binnen de omgeving van die cellen, wat bekend staat als cel-niet-autonomie.

We maken deze mozaïeken door cellen te transplanteren tussen wild-type of mutante embryo's in het blastula- of vroege gastrula-stadium. Vervolgens beoordelen we de genfunctie door het fenotype en genotype van de donorafgeleide cellen in hun gastheeromgeving te observeren. Laten we beginnen.

In dit deel van het protocol wordt een lineage-kleurstof in het donorembryo geïnjecteerd, zodat het lot van de uit de donor afgeleide cellen na transplantatie gevolgd kan worden. Met deze techniek kunnen ook diverse soorten nucleïnezuren worden geïnjecteerd; laat echter de decoratiestap achterwege bij het injecteren van DNA. Bereid vóór het werken met de embryo's een injectieschaal voor door een glazen objectglas in een hoek van 45 graden over het breedste deel van een Petrischaal te plaatsen. Vul deze voor driekwart met 1,2% aros in pen strep embryo-medium.

Verwijder het glaasje nadat de agar is gestold om een afgeschuinde goot te vormen. Vul de goot met pen strep embryo-medium. Ga nu verder met de enzymatische decoratie van embryo's in één celstadium.

Incubeer de embryo's in het ene-celstadium gedurende één tot vijf minuten in een 0,5 mg/mL Pronase-oplossing. Monitor de dechorionatie nauwgezet.

Zodra het chorion zichtbaar begint in te klappen, dompelt u de embryo's onder in systeemwater. Giet vervolgens al het chorion af, terwijl de embryo's onderin de bodem van de bekerglascurve blijven. Het is zeer belangrijk dat de embryo's niet nogmaals het wateroppervlak raken. Bij de meeste embryo's is het chorion nu verwijderd; er zijn er nog enkele die aan de buitenkant rondzweven en dat niet zijn.

Als er nog embryo's in het chorion zitten, zullen ze door het pipetteren op deze manier worden verwijderd en vervolgens worden vrijgelaten, zodat ze het wateroppervlak nooit raken. Het is belangrijk om gecoate embryo's te hanteren met een pipet waarvan de randen zijn gladgestreken door middel van vuurpolijsting. Breng de fragiele, met dec gecoate embryo's voorzichtig over naar het reservoir van de injectieschaal met een vuurgepolijste glazen pipet met een wijde opening.

Vervolgens plaatsen we een enkel bestand in deze goot. De embryo's zijn nu klaar om te worden geïnjecteerd met een lineage-marker met behulp van een nauwkeurig gekalibreerde, met vuur getrokken glazen injectiepipet en een drukinjectieapparaat. We gebruiken een schaal gevuld met embryo-medium om de naald af te breken en een schaal gevuld met olie om de naald te kalibreren.

Dit is gewoon een reguliere minerale olie van standaard laboratoriumkwaliteit. We nemen een paar geslepen horlogemakerspincetten en terwijl we door de oculairs kijken om de juiste grootte te bepalen, plaatsen we de pincet aan weerszijden van de naald en breken we vervolgens voorzichtig de chip af, wat ik overigens niet kan doen zonder te kijken. Om het volume van de kleurstof of ribonucleotide dat wordt afgeleverd te bepalen vóór aanvang.

Meet de bolusgrootte in een schaaltje met minerale olie. De naald moet worden afgebroken zodat er met één of twee pulsen van de micro-injector een bolus van één nanoliter wordt afgegeven. Het volume van de bolus kan worden berekend op basis van de diameter, gemeten met een oculairmicrometer.

Injecteer één nanoliter van een 1 tot 3% oplossing van fluorescent dextraan rechtstreeks in de dooier van gecoate embryo's tussen het stadium van één en vier cellen. Ik ga het embryo precies onder de naald positioneren. Vervolgens steek ik de naald voorzichtig in het centrum van de dooier en druk ik op het voetpedaal.

Bij het injecteren is het belangrijk om in de dooerstromen te injecteren, zodat de kleurstof naar de cellen wordt getransporteerd. Deze injectie is voldoende om cellen in chimere embryo's gedurende meerdere dagen van de ontwikkeling te volgen. Idealiter doen we dit voordat de cellen het viercelstadium bereiken. Kweek de geïnjecteerde embryo's bij een lage dichtheid in een gecoate Petrischaal gevuld met vers pen strep embryo-medium.

Houd er rekening mee dat geïnjecteerde embryo's een iets vertraagd ontwikkelingstempo hebben; incubeer embryo's bij verschillende temperaturen, 25, 28 en 31 °C, om hun ontwikkeling te spreiden en het tijdsbestek waarbinnen transplantaties kunnen worden uitgevoerd te maximaliseren. De apparatuur die wordt gebruikt voor celtransplantatie in de zebravis-blastula bestaat uit een door een drive aangestuurde Hamilton-spuit, die via een driewegkraan is verbonden met een reservoir met minerale olie en met een micropipethouder via een stuk flexibele slang. Verwijder alle luchtbellen uit het systeem, omdat deze de controle over de zuigkracht en druk onmogelijk maken.

Gebruik een stereomicroscoop met hoogwaardige optiek van ten minste een DX-vergroting. Om de positionering van de micropipethouder en de naald te regelen, raden wij een NARA shige handmatige micromanipulator aan. Zorg ervoor dat deze met een magnetische voet aan de tafel is bevestigd om te voorkomen dat trillingen worden overgedragen op het transplantaat.

Transplantatienaalden worden gemaakt van glazen capillaire pipetten die met een elektrodepolar tot een geleidelijke taps toelopende vorm worden getrokken. Raadpleeg het JoVE-protocol van het laboratorium van Miriam Goodman voor details over het trekken van pipetten onder een dissectiemicroscoop; breek vervolgens de punt van de getrokken naald af. Voor transplantaties in het blastulastadium moet de buitendiameter van de naald ongeveer 50 tot 60 microns bedragen, of 30 tot 40 microns voor een transfer in het gastrulastadium.

Voor een overdracht in het maagstadium om de penetratie te verbeteren, moet eerst met een micro-smede een scherpe weerhaak aan het uiteinde van de naald worden getrokken; maak de punt van de naald glad door deze dicht bij het filament van de micro-smede te brengen. Draai de naald vervolgens zodat de voorzijde van de schuine slijping contact kan maken met het filament. Zodra de voorzijde van de naald het filament raakt, trek je deze snel weg om een weerhaak te creëren.

Om beschadiging van cellen te voorkomen, moet de weerhaak recht zijn en de punt van de naald mag niet buigen. Nu de opstelling en de transplantatienaalden gereed zijn, kunt u beginnen met het maken van chimere embryo's. Blastulatransplantaties worden gebruikt om cellen tussen embryo's over te plaatsen wanneer gedetailleerde informatie over de fate map niet vereist is. Met uitzondering van de primordiale kiemcellen zijn de meeste cellen in dit stadium over het algemeen nog niet gebonden aan een specifiek lot.

De lotingskaart van de blastula is zodanig dat we onderscheid kunnen maken tussen cellen die het ectoderm zullen vormen en cellen die het mesoderm zullen vormen. De mesodermale en endodermale cellen bevinden zich nabij de rand van het embryo in het blastulastadium, terwijl de dermale progenitoren, die het zenuwstelsel en de oppervlakkige derm zullen vormen, verder van de rand van het embryo afliggen. Wanneer we cellen transplanteren in embryo's in het blastulastadium, kunnen we deze cellen dus richten op het presumptieve mesoderm of het presumptieve ectoderm.

Maar we kunnen cellen niet naar een specifiek gebied van het ectoderm of het mesoderm richten omdat we niet weten waar de dorsale zijde van het embryo zich bevindt in het blastulastadium. Bereid de injectieschalen vooraf voor door een plastic mal met gepaarde rijen wigvormige uitsteeksels te laten drijven in een Petrischaal die half gevuld is met gesmolten 1,2% agarose in embryo-medium. Zodra de agarose is gestold, wordt de mal verwijderd, waardoor rijen driehoekige putjes overblijven die elk net groot genoeg zijn om één embryo te bevatten.

Vul de transplantatievorm met pen strep embryo-medium en breng blastula-stadium embryo's individueel in elke put aan met een vuurgepolijste glazen pipet. Transfer de embryo's nu naar de transplantatieputten en laat ze in eerste instantie op hun zij liggen. Arrangeer de embryo's zodanig dat de donor-embryo's in één kolom worden geplaatst en de gastheer-embryo's in de aangrenzende kolom.

Plaats de schaal op de tafel zodanig dat de embryo tegen de achterwand van de put wordt gedrukt wanneer de transplantatienaald het embryo binnendringt. Breng de transplantatienaald met behulp van de micromanipulator onder een vrij steile hoek in de schaal. Idealiter dringt de transplantatienaald het embryo binnen onder een hoek van ongeveer 45 graden.

Zodra de punt van de naald zich onder het oppervlak van het embryo-medium bevindt, zuigt u een kleine hoeveelheid embryo-medium in de naald door aan de micrometer-aandrijving van de Hamilton-spuit te draaien. Voor de meest precieze controle moet de interface tussen de minerale olie en het embryo-medium in het dunne, taps toelopende deel van de naald blijven, maar niet te dicht bij het uiteinde. Positioneer het donor-embryo voorzichtig met de naald, trek de naald vervolgens terug en penetreer de blastulakap van het embryo op de gewenste positie.

Een snelle, harde stoot zal het embryo penetreren zonder dat het gaat rollen. Zuig de donorcellen langzaam en voorzichtig in de naald op om het afschuiven van de cellen te voorkomen. Vermijd het opzuigen van dooier in de naald nadat het gewenste aantal cellen is opgenomen.

Keer de druk lichtjes om om de zuigkracht te stoppen en verwijder de naald om het gastembryo in positie te brengen. Door het transplantatieschaaltje te bewegen, kunnen kleine aanpassingen aan de positie van het gastembryo worden gemaakt door het voorzichtig te draaien met de transplantatienaald, mits er zorgvuldig wordt toegepast om de dooier niet aan te raken. Vermijd bij het uitstoten van de donorcellen in het gastembryo dat er dooier in het embryo wordt opgenomen, omdat dit de donorcellen zal beschadigen en doden; donorcellen van één enkel donorembryo kunnen naar meerdere gasten worden getransplanteerd nadat de celoverdrachten zijn voltooid.

Breng de donor-gastheerparen over naar de gecoate putjes van een 24-wells plaat om de ontwikkeling voort te zetten. De enige uitzondering op de regel dat cellen in het blastulastadium nog niet zijn toegewezen aan specifieke lotgevallen, zijn de primordiale kiemcellen. Primordiale kiemcellen worden zeer vroeg in de ontwikkeling gespecificeerd en zijn toegewezen aan hun lot als primordiale kiemcel.

Al in een zeer vroeg stadium liggen de primordiale kiemcellen nabij de rand van een blastula en een embryo in het gastrulatiestadium. Als het doel van het transplantatie-experiment dus is om primordiale kiemcellen te transplanteren, is het zeer belangrijk waar de cellen vandaan komen in het donorembryo, en niet belangrijk waar ze terechtkomen in het gastembryo. De regel is dat voor somatische cellen de plek waar ze in het gastembryo terechtkomen bepalend is voor hun lot.

In het geval van primordiale kiemcellen is het van belang waar ze vandaan komen in het embryo van de donor, omdat hun lot al is bepaald. Als het doel is om primordiale kiemcellen te transplanteren, moeten deze cellen worden opgenomen vanaf de rand van het donor-embryo; ze bevinden zich vlakbij de rand van het embryo in vier kleine clusters van elk drie of vier cellen in dit vroege stadium van ontwikkeling. U moet ze zeer voorzichtig opzuigen om te voorkomen dat u per ongeluk ook het eigeel opzuigt.

Oké, dat is wat ik daar heb gedaan, en nu ga ik over naar een gastembryo. De primordiale kiemcellen zullen nu migreren naar de regio van de genitalenkam van welk embryo ze zich ook bevinden. Er is dus geen noodzaak om deze primordiale kiemcellen naar de rand te transplanteren; ze komen daar zelf terecht.

Ik transplanteer ze dus gewoon terug op een willekeurige plek in het post-embryo. De sleutel voor kiemceltransplantaties, wat precies het tegenovergestelde is van elk ander type transplantatie, is dat het uitmaakt waar de donorcellen vandaan komen. Door cellen te transplanteren in een gastheer in het gastrulatiestadium kan de experimentator gebruikmaken van de fate map van de zebravis die ontstaat zodra het embryonale schild zichtbaar wordt.

Het wordt mogelijk om verschillende weefseltypen te onderscheiden, evenals de domeinen binnen het presumptieve centrale zenuwstelsel. Bij het overbrengen van cellen tussen embryo's in het gastrula-stadium zijn er enkele variaties in het protocol, maar de algemene procedure is vergelijkbaar met het werken met blastulae om gastrulae te monteren. Smeer eerst een verticale streep Methylcellulose in de inkeping van een glazen concave objectglas en vul deze vervolgens met een royale hoeveelheid pen strep embryo-medium met behulp van een vuurgepolijste transferpipet.

Plaats één donor en drie gastheren in het schildstadium op het depressieglaasje. Selecteer donorembryo's die iets jonger zijn dan de gastheren. Voor het manipuleren van de gastros-lijm is een nieuw instrument vereist: de uiteinden van een kort stuk vislijn met een treksterkte van twee pond, bevestigd in het uiteinde van een capillaire buis.

Maak zo een kleine lus. Gebruik de lus om de donor- en gastembryo's voorzichtig naar boven over de Methylcellulose-strip te rollen en druk ze in de Methylcellulose tot ze stevig vastzitten. Rol ze in positie zodat de doelregio naar boven is gericht.

Aangezien de naald tijdens de transplantatie tangentieel het embryo binnendringt om de donorcellen af te leveren zonder de dooier te beschadigen, worden transplantaties in het gastrula-stadium bij voorkeur uitgevoerd op een compoundmicroscoop met een vaste tafel. Gebruik de bedieningselementen van de micromanipulator om de punt van de transplantatienaald in focus te brengen.

Positioneer de houder van de micropipet en de naald in een vrij flauwe hoek, zodat de naald zo horizontaal mogelijk staat als de rand van de uitsparing op het objectglas toelaat. Doorboor vervolgens het donorembryo. Indien het embryo correct is gemonteerd, zal het niet wegrollen wanneer de transplantatienaald binnendringt, tenzij het embryo te oud is om de naald gemakkelijk te laten penetreren.

Om te voorkomen dat de dooier wordt doorboord, moet de naald het embryo binnengaan op een brandvlak dat slechts iets dieper ligt dan dat van de EDL. Eenmaal doorboord kan een groot aantal cellen van de donor worden verwijderd voor maximaal drie injecties in de gastheercel. Vermijd bij het opzuigen van cellen dat er dooier wordt meegezogen door de naald indien gewenst te bewegen terwijl de cellen worden opgenomen.

Met dezelfde naald kunnen extra embryo's worden geoogst om meer cellen te verkrijgen voordat de cellen in de gastheer worden geïnjecteerd; stoot de cellen uit terwijl de naald door het doelgebied wordt getrokken in plaats van de cellen als één klomp te plaatsen tijdens de injectie in het gastheemembryo. Dit vergroot de kans dat de donorcellen bijdragen aan het gewenste weefsel. Zodra de celtransfer is voltooid, wordt de gehele objectglas in een petrischaal geplaatst en voorzichtig overstroomd met pen strep embryo-medium.

Gedurende de volgende paar uur zal de methylcellulose oplossen, waardoor de embryo's vrijkomen. Het aantal overgeplaatste cellen hangt af van het specifieke doel van het experiment. Cellen van een enkele donor kunnen de ochtend na transplantatie in drie of vier gastherdieren worden getransplanteerd.

Gastheren kunnen worden onderzocht om vast te stellen of de targeting van donorcellen succesvol was. Succesvolle transplantatie van primordiale kiemcellen uit het blastula-stadium resulteert in fluorescent gelabelde cellen, ventraal gepositioneerd nabij de overgang tussen de ylk en de ylk-extensie. We hebben u zojuist laten zien hoe u transplantaties in het gastrula- en blastula-stadium uitvoert.

Bij het uitvoeren van deze techniek is het belangrijk om de juiste transplantatiemethode te kiezen voor het doelvewesel dat u met uw cellen wilt targeten. Zo is transplantatie in het blastula-stadium voldoende om te bepalen of de cellen naar het mesoderm of het ectoderm gaan. Deze techniek kan ook worden gebruikt om primordiale kiemcellen te targeten.

Als u een nauwkeurigere mapping wilt uitvoeren, is het beter om een gastros-leeftijdstransplantatie te gebruiken waarbij de dorsale zijde al is bepaald. Met deze techniek kunt u cellen richten op verschillende delen van het zenuwstelsel, in het bijzonder de voorhersenen, middenhersenen, achterhersenen en het ruggenmerg. Dat is alles.

Hartelijk dank voor het kijken en veel succes met al uw experimenten.