Het visualiseren van de Beating Heart in Drosophila

Hier worden twee technieken gepresenteerd voor de visualisatie van een kloppend hart in Drosophila voor de dissectie van het volwassen hart. Eerst worden de kop en thorax verwijderd door een enkele snede langs de aangegeven lijn. Vervolgens worden de genitaliën verwijderd en wordt de abdominale lichaamsholte geopend met een pincet; de darm en, in het geval van een vrouwelijke vlieg, de eierstokken worden verwijderd.

Het abdominale vetlichaam in abdominale segmenten drie en vier wordt zorgvuldig weggezogen om het volwassen hart bloot te leggen voor de immobilisatie van het larvale hart. Een enkele larve die in een bufferoplossing is geplaatst, wordt gefixeerd door eerst histo acral-lijm aan te brengen rond de kopregio van de larve. De larve wordt voorzichtig uitgerekt en er wordt meer lijm aangebracht op het posterieure uiteinde, en vervolgens op de flanken van de lichaamswand van de larve.

Hoi, ik ben GI Fler. Hoi, ik ben Karen er. We zijn beiden leden van het programma Ontwikkeling en Veroudering aan het Burnham Institute for Medical Research.

Vandaag laten we u de procedures zien die we hebben ontwikkeld om het kloppende hart van larvale en volwassen drosophila te visualiseren. We gebruiken beide preparaten om hartslagparameters bij de fruitvlieg, Drosophila, te visualiseren, te onderzoeken en te kwantificeren. Voordat we beginnen, bereiden we eerst een kunstmatige hemolymfe-oplossing voor.

Deze oplossing bevat sucrose, helo, die vlak voor gebruik vanuit gekoelde voorraadoplossingen aan de kunstmatige hemolymfe moet worden toegevoegd. Om bacteriële contaminatie te voorkomen, moet de kunstmatige hemolymfe op kamertemperatuur worden gebracht en de oplossing gedurende ten minste 15 minuten worden gezatureerd met zuurstof door middel van luchtbellen. Trek vervolgens met een standaard pipette-puller enkele fijne capillairen, die nodig zullen zijn voor het verwijderen van vetlichamen in de vlieg.

Zodra alles is voorbereid, moeten de volwassen vliegen worden genarceerd. Dit kan door ze gedurende twee tot vijf minuten kort bloot te stellen aan fly nap, maar zorg ervoor dat de vliegen niet langer dan vijf minuten in de fly nap blijven. Kortstondige blootstelling aan kou kan ook worden gebruikt om de vliegen te narcotiseren, maar koolstofdioxide wordt niet aanbevolen vanwege de langdurige effecten op de hartslag en mobiliteit.

Vervolgens worden de genarceerde vliegen met de rugzijde naar beneden in een Petrischaal geplaatst die is bekleed met een dunne laag vaseline. De hydrofobe cuticula van de vleugels en het lichaam zou reversibel aan de vaseline moeten hechten, maar de vlieg kan indien nodig opnieuw worden gepositioneerd. Er wordt een eerste incisie gemaakt met een gebogen veerschaartje.

Dit gebeurt door de schaarbaden onder de poten van de vlieg te plaatsen en deze schuin naar beneden te richten naar het dorsale oppervlak nabij de nek. Zodra er is geknipt, worden de kop, het ventrale zenuwstreng en de poten met één enkele snede verwijderd. De preparaat wordt vervolgens met een veerschaar ondergedompeld in de gezuurstofte vloeistof van kunstmatige hemolymfe.

De posterieure punt van het abdomen, bestaande uit abdominale segment zeven en acht, wordt met één snede verwijderd. Dit biedt toegang voor het maken van laterale sneden langs beide randen van het abdomen en dient om de verbinding tussen het posterieure darmkanaal en de abdominale cuticula door te snijden. Steek de schaarbladen in de kleine opening in de punt van het abdomen en snijd de cuticula lateraal door.

Hierdoor komt één rand van de ventrale cuticula vrij. Pak de flap met een pincet vast en maak een soortgelijke snede langs de tegenoverliggende laterale rand van het abdomen. De vrijgekomen flap van de ventrale abdominale cuticula kan nu worden verwijderd.

De darmen en andere abdominale organen kunnen gewoonlijk als één geheel worden verwijderd met behulp van pincetten en voorzichtig trekken. Het verwijderen van de interne organen legt de kloppende hartbuis bloot, die nog via kleine spiervezels aan de dorsale cuticula is bevestigd en omgeven is door vetlichamen. De getrokken capillairen worden ingebracht in plastic buisjes van 1/16 inch die zijn aangesloten op een vacuümpomp.

De zuigkracht is proportioneel aan de diameter van de tip, waardoor pipetten met tips met een diameter groter dan 40 microns niet gebruikt mogen worden zodra deze zijn ingesteld. Dit zuigsysteem wordt gebruikt om overtollig vet rondom de hartbuis af te zuigen. Het kan ook worden gebruikt om luchtbellen die zich rond de cuticula ophopen en eventueel debris te verwijderen.

Er moet uiterste zorg worden betracht om contact met het hart zelf te vermijden, en aangezien het posterieure deel van het hart zeer fragiel is, moet deze regio tevens worden vermeden. De hartbuis van de volwassen drosophila is nu blootgelegd en zou, indien nodig, moeten kloppen. De cuticula en het vastgehechte hart kunnen worden herpositioneerd door de cuticula voorzichtig uit de vaseline te tillen en deze vervolgens zorgvuldig weer terug te drukken.

Vermijd elk contact met het hartweefsel. Op dit punt moet de oplossing waarin het preparaat ligt, worden vervangen door verse kunstmatige hemolymfe. Dit preparaat moet gedurende 20 tot 30 minuten onder oxygenatie equilibreren voordat er manipulaties worden uitgevoerd.

Als de preparatie langer dan 60 minuten in stand moet worden gehouden, moet deze opnieuw worden geperfuseerd met verse kunsthemolymfe. Deze preparatie is nu klaar voor gebruik bij optische registratie en kan ook worden gebruikt voor elektrofysiologische registratie of voor histologische manipulaties. Voor het visualiseren van het kloppende hart in de larven is een andere techniek vereist.

Bereid eerst de dekglasjes voor op de dag vóór de procedure. Dit gebeurt door met een tandenstoker ongeveer 50 tot 70 µL Sylgard-oplossing op een dekglasje van 22 bij 22 millimeter over te brengen. Laat de Sylgard gedurende de nacht uitharden bij 65 °C.

Maak vervolgens de Brody- en Bates-buffer; zodra deze bereid is, kunnen aliquoten worden bewaard bij -20 °C en ontdooid worden wanneer nodig. Bereid tot slot de benodigdheden voor het aanbrengen van de histo-acryllijm. Trek eerst enkele fijne capillairen.

Verbind vervolgens een pipetpunt van 1,5 milliliter met een klein plastic slangetje met een diameter van ongeveer 1/32 inch. Plaats een capillair door het smalle uiteinde in het slangetje te steken, waarbij de brede opening aan het andere uiteinde is gericht. Zodra dit is opgezet, wordt het capillair gevuld met histo glue door het capillair in een druppel lijm te dopen en deze voorzichtig op te zuigen in de plastic punt.

Bij het werken met de lijm dient men een tweede glazen capillair bij de hand te hebben om overtollige lijm van de punt van het lijmcapillair te verwijderen. De lijm is vloeibaar totdat deze in contact komt met gebufferde zoutoplossing, waarna deze binnen enkele seconden uithardt. Meestal blijft de lijm echter lang genoeg plastisch om deze van de punt van het lijmcapillair te kunnen verwijderen of aan te brengen op het specimen.

Om nu te beginnen met de immobilisatie van de larven, plaatst u een druppel histo acral-lijm dicht bij elke hoek van het syl guard-dekglas. Voeg 50 µL B&B-buffer toe aan de lijmdruppels, die onmiddellijk zullen uitharden, en vul de ruimte tussen de gelijmde plekken met B&B-buffer. De lijm houdt de buffer op het objectglas vast.

Neem een dwalende L3-larve en plaats deze gedurende twee minuten op een stukje natten weefselpapier op ijs. Dit zal de beweging vertragen. Breng de larve vervolgens over naar de buffer en positioneer deze met de dorsale zijde naar boven.

Dit is de zijde van de larven waar de identieke banden ontbreken. Breng snel wat lijm aan tussen de kopregio en de drempelbescherming. De lijm zal zeer snel uitharden en voorkomen dat de kop van de larven beweegt.

Pak het dier voorzichtig met een pincet vast bij de posterieure sparkles en rek het zachtjes uit. Fixeer de larven in deze positie door de lijm langs beide zijden van de larven aan de posterieure helft aan te brengen. Voeg meer lijm toe aan de flanken van het dier om verdere beweging van de cuticula door de spieren van de lichaamswand te verminderen.

De larve is nu in deze positie gefixeerd. Het dekglas kan in een kleine Petrischaal gevuld met kunstmatige hemolymfe of PBS worden geplaatst, waarna hartslagen kunnen worden geregistreerd zonder interferentie van bewegingen van de lichaamswand. Het semi-intacte hart van de volwassen Drosophila zal na dissectie urenlang ritmisch kloppen wanneer het wordt onderhouden in verse, zuurstofrijke kunstmatige hemolymfe.

Een representatief voorbeeld is hier en in aanvullende video één te zien van harten van larven in het derde stadium; jonge vliegen van één tot drie weken oud vertonen over het algemeen een regelmatige hartslag met frequenties tussen 1 en 3 Hz, terwijl vliegen ouder dan drie weken over het algemeen meer aritmisch zijn. Desondanks zijn deze harten nog steeds in staat om urenlang spontaan te kloppen in zuurstofrijke kunstmatige hemolymfe. Harten van volwassen vliegen die beschadigd zijn geraakt als gevolg van de dissectieprocedure vertonen doorgaans gelokaliseerde regio's van extreme constrictie die niet kunnen ontspannen en vaak ongecontroleerd kloppen. Hartslagen trager dan 1 Hz worden zelden waargenomen bij vliegen jonger dan drie weken oud.

Bijgevolg worden dergelijke preparaten als beschadigd beschouwd en weggegooid. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u harten van fruitvliegen in het larvale stadium en van volwassen fruitvliegen kunt prepareren voor optische beeldvorming. Onthoud dat u bij het maken van het semi-intacte preparaat het hart zelf nooit mag aanraken.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.